7.2. Мониторинг киллерной активности лимфоцита

Всего несколько лет назад в модельных системах in vitro удалось зримо представить механизмы, с помощью которых реализуется эффектное звено клеточных взаимодействий, направленное на элиминацию чужеродных субстанций, попавших в организм. Эта модельная система — клеточный цитолиз в различных его типах и их вариантах — CML и D-CML (см. 2.3.2 и 4.3.2) и ADCC (см. 2.2.3). Есть достаточно оснований считать, что названные модельные системы являются аналогами процессов, разыгрывающихся в организме при ситуации, связанной с элиминацией «чужого», например трансплантированной ткани. Данные типы эффекторных реакций осуществляются клетками-киллерами, для которых необходима предварительная сенсибилизация - прямая (CML) или через посредство антител (ADCC).

Недавно в крови человека обнаружены клетки, осуществляющие киллерные реакции по отношению к мишеням, с которыми организм в нормальных условиях не встречается, т. е. киллеры, развивающие активность без предварительной сенсибилизации и получившие название натуральных (спонтанных) киллеров. Об их функциях in vivo практически ничего не известно. Мы предположили, что коль скоро есть основа для "натурального киллинга", он может вовлекаться в процесс отторжения трансплантата. Несколько видов мониторинга киллерной активности лимфоцитов и мононуклеаров рассмотрены ниже.

7.2.1. D-CML как тест иммунологического мониторинга

Одним из наиболее интересных и информативных видов контролирования киллерной активности лимфоцита является динамическое использование CML, а именно ускоренного его варианта, т. е. D-CML [Eijsvoogel V. et al., 1973; Garovoy M. et al., 1973]. Схема метода представлена на рис. 13 (см. 2.2.2).

Л. П. Алексеев (1978) оценивал с помощью этого теста киллерный эффект лимфоцитов реципиента по отношению к антигенам кадаверного трансплантата. В качестве антигенного материала были использованы спленоциты донора, сохраненные в криоконсервирующей среде, которые в дальнейшем служили мишенями в D-CML-тесте.

Было замечено, что в период стабильной функции аллотрансплантата киллерная активность лимфоцитов реципиента была невысока как по отношению к клеткам донора, так и по отношению к клеткам 3-го партнера. Однако при кризах отторжения наблюдалось специфическое возрастание киллерной активности Т-лимфоцитов реципиента только по отношению к клеткам донора (табл. 61).

Нами [Алексеев Л. П., Зарецкая Ю. М. и др., 1980] проведена оценка возможностей D-CML как теста иммунологического мониторинга кризов отторжения. Было определено, что средние значения киллинг-эффекта (19 случаев) по отношению к мишеням донорского генотипа составляли 5,4 ± 1,9%, в то время как в период криза отторжения (17 случаев) средние значения специфического киллинга соответствовали 28 ± 4,9%.

Во всех зарегистрированных случаях криза отторжения имела место активация D-CML; в период стабильной по клиническим показателям функции трансплантата активация D-CML имела место только в трех случаях. Коэффициент корреляции между активацией D-CML и манифестацией криза отторжения, вычисленный из "таблицы 2 × 2", оказался равным 0,85, что свидетельствует о высокой информативности D-CML как теста иммунологического мониторинга.

Таблица 61

Далее нами изучены условия, которые следует расценивать как оптимальные для осуществления D-CML-мониторинга: соотношение между мишенями и киллерами и вид клеток-мишеней.

Испытание оптимального соотношения между мишенями и киллерами производили на донорских спленоцитах. Оказалось, что наиболее эффективный киллинг имеет место при соотношении мишеней и киллеров 1 : 25, хотя диапазон, при котором можно получить значимые цифры, значительно шире - от 1 : 100 до 1 : 10 (табл. 62).

Таблица 62

Для определения "оптимального" вида мишеней испытанию подверглись "замороженные-оттаянные" лимфоциты периферической крови и спленоциты донора, стимулированные ФГА.

Как следует из табл. 63, уровень киллинга при использовании спленоцитов в роли клеток-мишеней значительно превосходил таковой при использовании периферических лимфоцитов. Это обстоятельство очень важно в клинико-практическом отношении, так как селезенка донора более доступный материал, нежели периферическая кровь.

Таблица 63

Таким образом, наши исследования показали, что D-CML является информативным тестом для диагностики кризов отторжения.

7.2.2. Мониторинг активности натуральных киллеров (NK-тест)

Как упоминалось выше, в крови человека обнаружены натуральные киллеры [Jondal М., Pross Н., 1975], обладающие спонтанной активностью in vitro, направленной против опухолевых клеточных линий аллогенной и ксеногенной природы (см. R. Floyd et al., 1979). Природа натуральных киллеров (NK) неизвестна; считают, что они не принадлежат ни к Т- или В-лимфоцитам, ни к макрофагам, ни к моноцитам; предполагается, что это специальный вид мононуклеаров, происходящих из костного мозга и независимых (автономных) от тимуса [Leibold М., Pater М., 1978].

Биологическая роль NK-клеток пока совсем не ясна. Поскольку in vitro они развивают активность преимущественно против опухолевых линий, предполагается, что in vivo они участвуют в контроле аберраций клеток, в контролировании элиминации клеток раннего опухолевого развития и в регуляции гомеостаза [Leibold W. et al., 1978; Floyd R. et al., 1979]. Выдвинуто предположение о возможном участии NK в отторжении аллогенного трансплантата [Leibold W., Peter М., 1978], осуществляемом или посредством прямого участия NK в киллинг-эффекте, или посредством "рекрутирования" специфических Т-киллеров в цитотоксический эффект; последний механизм был показан с использованием в качестве мишени опухолевых клеток линии К-562 [Masucci G. et al., 1980].

Мы предположили, что спонтанная активность натуральных киллеров, не примированная никаким антигенным стимулом, служит отражением нормальной активности гена иммунного ответа, постулируемого у человека (6. 3. 1), и в этом отношении должна испытывать флюктуации, зависящие от напряженности иммунных процессов в организме.

Удобство работы с NK заключается в том, что система мишеней при использовании, например, перевиваемых клеточных линий всегда стабильна, "нейтральна" по отношению к NK-клеткам, следовательно, интенсивность киллинга является исключительно функцией самих NK.

NK-тест был испытан нами (Ю. М. Зарецкая, Р. А. Бурханов) в иммунологическом мониторинге кризов отторжения. Ниже приведена модификация метода тестирования NK-активности, выполненная Р. А. Бурхановым на основе техники М. Jondal, S. Targan (1978) с использованием в качестве мишени миелоидной перевиваемой линии К-562, которая определена как высокочувствительная мишень в цитотоксическом тесте с NK [West W. et al., 1977; Collewart С. et al., 1979; Kail N.. Kokeh H., 1979].

Культивирование клеток-мишеней:

- клеточная линия К-562 выращивалась на культуральной среде. RPMI-1640 (Flow lab. U. К.), которую обогащали "добавками": 500 мл RPMI-1640 + 20mМ глютамина +20 mM Hepes (Serva) +100 ед/мл пенициллина +10 ед/мл стрептомицина или гентамицина; как сывороточную Добавку использовали инактивированную бычью сыворотку;

- в стерильный пенициллиновый флакон помещали 0,6 мл перевиваемой клеточной суспензии (содержащей 3 × 10⁵ клеток), 0,6 мл инактивированной бычьей сыворотки и 1,8 мл среды RPMI-1640; флаконы инкубировали 4 сут при 37°С;

- на 4-е сутки культивирования, когда концентрация клеток достигала 5 × 10⁵ в 1 мл, клетки перевивали в свежую среду.

Приготовление мишеней к опыту:

- клетки 2-го или 3-го дня культивирования осаждали центрифугированием при 150 g в течение 5 мин, ресуспендировали в свежей среде RPMI-1640 с добавлением 10% бычьей сыворотки; с помощью трипановой сини определяли процентное содержание жизнеспособных клеток, которое должно составлять не менее 95 - 97;

- 1 × 10⁶ клеток метили 250 μCi⁵¹Cr (Na₂CrO₄) (92,5 × 10⁵ БК) с удельной активностью 2 - 5 mCi/мМ (7,4 - 18,5 × 10⁷ Бк) в объеме 0,5 мл, помещали в термостат и инкубировали в течение 1 ч при 37°С;

- клетки трижды отмывали в среде Хенкса с 5% бычьей сывороткой, центрифугируя при 150 g 5 мин; конечную концентрацию клеток доводили до 1 × 105 в 1 мл среды RPMI-1640 с 10% бычьей сывороткой.

Выделение киллеров:

- венозную кровь (6 мл) забирали в пенициллиновые флаконы с 0,2 мл 5% ЕДТА и разделяли в градиенте плотности фиколл/верографина (d = 1,077);

- полученную взвесь мононуклеарных клеток один раз отмывали в 8 мл фосфатного буфера (рН 7,2); две последующие отмывки производили в р-ре Хенкса + 5% бычьей сыворотки;

- определяли содержание жизнеспособных клеток с трипановой синью, которое не должно быть менее 95%; конечную концентрацию клеток доводили до 5 × 106/мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% бычьей сыворотки.

Постановка NK-теста:

- клетки-мишени по 0,1 мл (1 × 10⁴ клеток) раскапывали в лунки круглодонной панели фирмы "Соок" с учетом необходимого количества проб и объема опыта;

- клетки киллеры по 0,1 мл (0,5 × 10⁶ клеток) раскапывали так, чтобы для каждой пробы исследуемой крови приходился свой ряд лунок; как опытные, так и контрольные пробы тестировали в триплете; к контрольным пробам вместо 0,1 мл суспензии киллеров добавляли 0,1 мл культуральной среды, соотношение клеток-мишеней и киллеров в опытных пробах соответствовало 1 : 50;

- на этапе раскапывания мишеней по 0,1 мл суспензии клеток заливали в центрифужные пробирки и хранили до окончания опыта; они служили для определения максимального включения ⁵¹Cr (М);

- панель помещали в инкубатор (37°С) с подачей 5% CO₂ и относительной влажностью 100%, где инкубировали 16 ч;

- по окончании инкубации из лунок забирали 0,1 мл супернатанта, замеряли активность проб вместе пробами на γ-счетчике.

Подсчет цитотоксической активности:

- цитотоксическая активность NK-клеток выражалась в % с учетом общего включения ⁵¹Cr и его спонтанного выхода:

% лизиса = A - B/C - B × 100, где А - удвоенное среднее значение выхода ⁵¹Cr в трех опытных лунках; В - то же, но в контрольных лунках; С - 80% от общего включения ⁵¹Cr в 1 × 10⁴ клеток (М)-мишеней (введение С рекомендовано М. Jondal, 1978).

Спонтанный выход ⁵¹Cr (В) при такой постановке опыта в среднем составлял 16% от значения С (1% в час).

Уровень N К-активности у здоровых людей (27 человек) составил в среднем 53,6 ± 3,7%, а у больных с синдромом хронической почечной недостаточности (ХПН), определенный на 36 пациентах, - 48,8 ± 3,5%.

Активность NK была изучена и у реципиентов с аллогенной почкой в разные сроки после трансплантации и при различном функциональном состоянии трансплантата. Всего реализовано 59 исследований NK-активности, начиная со 2-го по 60-й посттрансплантационный день.

На рис. 33 представлены все значения киллинг-эффекта, распределенные в "колонки" в соответствии с функциональным состоянием трансплантата. Сразу после операции NK-активность (1а) была значительно снижена, чем у здоровых людей и в дооперационном периоде. Причиной снижения активности у больных ХПН служила, как мы считаем, усиленная иммунодепрессивная терапия, используемая в первые послеоперационные дни. В период стабильной функции трансплантата (16), в предкризовом периоде (II) или при купировании криза (IV) отмечены флюктуации в значении средней NK-активности, однако они не были статистически значимыми; в целом в эти периоды NK-активность снижена по сравнению с нормой.

Рис. 33. Активность NK-клеток у реципиентов с аллогенным почечным трансплантатом (по Ю. М. Зарецкой, Р. А. Бурханову). Точками обозначены конкретные величины киллинг-эффекта. I - при стабильной функции трансплантата: а - в первые 2 нед после трансплантации, б - в более поздние сроки; II- в предкризовый период; III - в период криза отторжения; IV - после купирования криза. Сплошная линия - среднее значение киллинг-эффекта у здоровых людей,, штриховая - среднее значение киллинг-эффекта у больных с ХПН (до трансплантации)

NK-активность в период кризовых ситуаций резко повышена по сравнению с активностью в периоды стабильной функции трансплантата и значительно превышает средние значения NK-активности у здоровых людей. Определение достоверности различия между средними значениями NK-активности по критерию Стьюдента показало, что во всех случаях различие достоверно при 95% вероятности.

Перед каждой кризовой ситуацией, таким образом, мы отметили подъем NK-активности; коэффициент корреляции между подъемом NK-активности и наступлением криза отторжения показал их высокую взаимосвязь (табл. 64).

Таблица 64

При анализе подъема NK-активности перед кризом (табл. 65) возрастание киллинга соответствовало ≈20%, если предшествующий анализ NK-активности был произведен в предкризовый период, т. е. за 2 - 5 сут до клинической манифестации криза, и мог достигать 40% и более, если предшествующий анализ был произведен в период стабильной функции трансплантата (9 - 10 сут до криза).

Наши исследования показали, что NK-тест имеет значительную информативную ценность, позволяющую рекомендовать его в качестве теста для иммунологического мониторинга кризов отторжения. К преимуществам этого теста относятся простота постановки, позволяющая обследовать одновременно кровь от 6 - 10 индивидуумов, и быстрота получения ответа (на следующий день).

Таблица 65

^*(В скобках - день после трансплантации, когда произведен анализ.)

7.2.3. Значение ADCC-теста в диагностике кризов отторжения

По-видимому, определенную перспективу (целиком пока не используемую из-за сложности реакции) имеет иммунологическое контролирование реакции антителозависимого лимфолиза (ADCC). Реакция, предложенная Q. Trinchieri (1973), выявляет киллерную активность лимфоцитов по наличию антител, специфичных к мишеням (см. 2.2.3).

F. Thomas et al. (1977) при использовании этого теста в мониторинге показали, что хроническое отторжение трансплантата связано с наличием позитивной ADCC.

Е. Etherag et al. (1979) нашли, что увеличение ADCC-активности по отношению к донорской ткани сопряжено с ухудшением выживаемости трансплантата и шансы выживаемости трансплантата падают еще более значительно, если позитивная ADCC сочетается с комплементзависимыми цитотоксическими антителами.

Сравнивая два теста, характеризующих киллерную активность лимфоцитов - CML и ADCC, С. Stiller и S. Sinclair (1979) установили, что коррелятивная связь между позитивной ADCC и кризами отторжения больше, чем связь кризов с MCL. P. Cauliunas и соавт. (1977) добавочно к ADCC проводили определение КЗЦТ в тесте с ⁵¹Cr и отметили хорошее совпадение этих двух показателей при кризах отторжения.