§ VII.2. Дарвиновская эволюция в пробирке

Получение очищенной Qβ-репликазы дало возможность поставить ряд интереснейших экспериментов, в которых определенный вид молекул подвергали давлению отбора посредством "серийных переносов" и заставляли их, таким образом, проделывать "эволюцию в пробирке". Эксперименты такого рода начинают с того, что берут стандартную реакционную смесь (см. [121]): 0,25 мл раствора содержат 10^-1 М трис-НСl, pH 7,4, 2⋅10^-2 М MgCl2, 3⋅10^-3 М ЭДТА, по 200 ммкмоль АТФ, УТФ, ГТФ, ЦТФ (УТФ помечен ³²Р в α-положении, причем 4000 расп/мин соответствует 1 мкг синтезированной РНК) и 40 мкг Qβ-репликазы (очищенной путем центрифугирования в градиентах CsCl и сахарозы). Подробное описание процедуры определения нуклеотидного состава, седиментационного анализа, а также различных анализов на ферментативную активность см. [120, 121].

Инкубируя эту смесь с вирусной РНК (в данном случае РНК чувствительного к температуре мутанта ts-1), инициируют синтез фермента и затем приготовляют серию разбавлений, перенося каждый раз после определенного времени инкубации 0,02 мл реакционной смеси в 0,25 мл свежего стандартного раствора. Первая реакция инициировалась 0,2 мкг РНК ts-1, которую инкубировали в течение 20 мин при 35°С. Затем время инкубации снижали от 20 мин (переносы 1-13) до 15 мин (переносы 14-29), до 10 мин (переносы 30-38), до 7 мин (переносы 39-52) и, наконец, до 5 мин (переносы 53-74), после чего получали конечный продукт. При каждом переносе брали 0,02 мл смеси для подсчета импульсов и еще 0,02 мл для инициирования реакции в следующей пробирке. В переносах 0, 8, 14, 29, 37, 53 и 73 некоторое количество продукта использовалось для инициирования синтеза РНК, которую брали затем для седиментационного анализа в градиенте сахарозы.

Анализ продуктов дал следующую информацию о реплицированных молекулах РНК (см. рис. 25): инфекционность была утрачена после 4-го переноса; молекулярные массы РНК-матриц по мере переносов более или менее постоянно снижались, пока после 74-го переноса не получился конечный продукт, утративший около 83% своей исходной генетической информации. Из 3600 нуклеотидных остатков родительской молекулы сохранилось только 550. Параллельно с уменьшением молекулярного веса наблюдается увеличение скорости включения ³²Р, так что к 74-му переносу скорость включения на один нуклеотид возросла в 2,6 раза по сравнению с начальной скоростью. Это прямо показывают исследования кинетики включения нуклеотидов в условиях насыщения. Рис. 26 служит примером: увеличение скорости в линейной области сопровождается уменьшением периода индукции, в течение которого количество минус-цепей должно возрастать вплоть до "уравновешенного" отношения плюс- и минус-цепей. В условиях специальных селекционных ограничений можно было наблюдать дальнейшее увеличение скорости, сопровождающееся уменьшением длины цепи до 180 нуклеотидных остатков. Эта фракция "мини-монстров" исследуется также в лаборатории Л. Оргела в Ла Хойя, Калифорния (личное сообщение С. Спигелмана).

Рис. 25. Эксперимент с серийными переносами РНК фага Qβ [121]. Описание в тексте. Стрелки над переносами 0, 8, 14, 29, 37, 53 и 73 указывают, что в этих случаях от 0,01 до 0,1 доли продукта использовали в качестве затравки для вспомогательной реакции, продукт которой подвергали седиментационному анализу в градиенте сахарозы. Время инкубации: 20 мин (переносы 0-13), 15 мин (переносы 14-29), 10 мин (переносы 30-38), 7 мин (переносы 39-52) и 5 мин (переносы 53-74). Результаты показывают, что биологически компетентная РНК перестает появляться после 4-го переноса. По оси ординат - радиоактивность (расп/мин на 0,25 мм) ×10^-5 (для большого графика) и ×10^-4 (для малого)

Рис. 26. Сравнение кинетики синтеза 74-го варианта (кривая I) и исходной РНК мутанта ts фага Qβ (кривая II) [121]. Инициированы две стандартные реакции (см. текст) в 0,25 мл смеси при 35°С. В одной реакции затравкой служила одноцепочечная 'вариантная' РНК (74-й перенос), очищенная гель-фильтрацией, в другой - РНК мутанта ts фага Qβ (в обоих случаях количество затравки выше уровня насыщения). В указанные моменты времени брали пробы по 0,02 мл и анализировали их на включение ³²Р-УТФ (расп/мин/0,02 мл)⋅10^-3

На первый взгляд результаты этих экспериментов отражают только тривиальный "эволюционный" ответ на данное предписание: "размножаться как можно быстрее". Молекулы РНК, освобожденные от необходимости быть инфекционными, приспосабливаются к таким "райским" условиям, отбрасывая всю информацию, которая не нужна для быстрой репликации. Однако они не могут сократить процесс репликации, просто обрывая цикл, прежде чем будет достигнуто место терминации, потому что для узнавания необходимы различные части молекулы, в частности оба ее конца. На самом деле сокращение временных интервалов между переносами не вынуждает к такому поведению. Реакция не обрывается вследствие переноса, и более вероятно, что молекула фермента, которая начала процесс репликации на матрице, закончит свое дело, а не отделится от нее, чтобы искать новую матрицу.

В сущности в эксперименте с серийными переносами создается приближение к условиям "постоянных реакционных сил", или постоянной "общей организации".

Концентрации, которые были в исходной стандартной реакционной смеси, - по крайней мере, концентрации высокоэнергетических мономеров АТФ, УТФ, ГТФ и ЦТФ - восстанавливаются при каждом переносе, поэтому сродство реакций образования в среднем находится на постоянном уровне. Сокращение промежутков времени между отдельными переносами позволяет компенсировать растущую скорость репликации. Однако, как показывает рис. 25, в опыте Спигелмана все-таки был некоторый дрейф стационарного состояния. Он вызван в основном тем, что селекционные ограничения выбирались интуитивно (что совершенно оправдано, поскольку эксперименты ставили с целью получить качественные результаты). Более строго заданные селекционные ограничения, обеспечивающие сохранение стационарного состояния при постоянных условиях, могут влиять на скорость эволюции; такие условия потребовались бы для количественных выводов.

Качественный вывод состоит в том, что система всегда благоприятствует виду, имеющему максимальную селективную ценность. В "райских" условиях экспериментов in vitro инфекционность является не условием, а помехой для быстрого воспроизведения. Этот пример ясно показывает, что, хотя селективная ценность всегда определяется параметрами скорости и узнавания A, Q и D, эти параметры могут резко меняться при изменении условий среды. В последующих работах С. Спигелман и сотрудники сообщили о выделении целого ряда мутантов, которые адаптировались к различным модификациям условий отбора in vitro. В число свойств, которые можно было встроить в эти "варианты", входит устойчивость к аналогам нормальных рибонуклеозидтрифосфатов или к таким ингибиторам, как этидийбромид. Оказалось возможным также производить отбор на виды с повышенным молекулярным весом, фиксируя фермент на мембране и благоприятствуя тем самым (длинным) цепям, которые лучше адсорбируются. Эксперименты с "голоданием" по одному из оснований, например цитозину, не дали мутантов, бедных этим основанием: фермент сумел приспособиться к изменившимся условиям и повысить эффективность включения цитозина. Все эти эксперименты свидетельствуют о колоссальной структурной и функциональной вариабельности и адаптивной способности одноцепочечных РНК и об их возможной роли на ранних стадиях эволюционного процесса.