3.4.1* Третий уровень организации хроматина: петли

Открытие ядерного скелета (остова) и приклепления к нему петель ДНК^1* [114-124]. Третий уровень компактизации ДНК в хроматине определяется дальнейшей укладкой 300 Å-фибриллы в петли, прикрепляющиеся своими концами к скелетным образованиям клеточного ядра или метафазных хромосом. Последние часто обозначают как ядерный матрикс и хромосомный остов соответственно.

Открытие ядерного матрикса было сделано в лаборатории И. Б. Збарского. В конце 40-х-начале 50-х годов были начаты активные исследования изолированных клеточных ядер А. Мирским в США и И. Б. Збарским в СССР. Мирский впервые описал негистоновые белки ДНП. И. Б. Збарский и С. С. Дебов провели анализ материала ядер, остающегося после удаления ДНП концентрированными солевыми растворами, и открыли в составе его кислый белок, растворимый в разбавленных щелочах, и нерастворимый остаточный белок.

В 1956 г. я начал свою работу в лаборатории И. Б. Збарского (Институт морфологии животных им. А. Н. Северцова АН СССР) и занялся по его предложению более детальным цитологическим анализом процесса фракционирования ядер по Збарскому и Дебову. Было установлено, что фракция кислого белка включает в себя материал как ядрышка, так и более мелких образований, рассеянных по ядру, а также выявляемых и в метафазных хромосомах.

Затем мы с Ю. С. Ченцовым провели электронно-микроскопический анализ изолированных ядер после их экстракции различными растворами и обработки нуклеазами (рис. 17). Наиболее интересные картины были получены после обработки ядер ДНКазой I с последующей экстракцией либо только 0,14 М NaCl, либо 0,14 М NaCl, затем 1-2 М NaCl. В первом случае в ядрах, хорошо сохранивших свою форму, хотя они и потеряли растворимые белки и часть ДНП (но не весь), выявлялись нитевидные образования диаметром 300-600 А. Если же мы дополнительно экстрагировали ядра 1-2 М NaCl, чтобы убрать полностью гистоны, то в ядрах на срезах были видны опять-таки ядерная мембрана, ядрышки и фибриллы, но их диаметр был меньше - около 100 Å, причем они состояли из нитей и гранул несколько большего диаметра (~200 Å). В световом микроскопе места скопления этого фибриллярного компонента окрашивались на РНК. Обработка РНКазой удаляла гранулярный компонент фибрилл. Было похоже, что такие фибриллы образовались из более толстых, получаемых на предыдущем этапе экстракции. Кстати, как те, так и другие во многих случаях контактировали с ядерной оболочкой, а иногда с ядрышком. После обработки препаратов разбавленными щелочными растворами в них оставались только ядерные оболочки. Таким образом, рибонуклеопротеины клеточного ядра образуют ядрышки и фибриллярный материал, располагающийся внутри ядра. Составляющие фибриллярный компонент нити были названы нами нуклеонемами.

В той же работе мы с Ю. С. Ченцовым выдвинули гипотезу об общей структурной организации клеточного ядра, согласно которой в основе каждой хромосомы лежит осевая структура, представленная нуклеонемой, прикрепляющейся концами к ядерной оболочке, а нити ДНП, в свою очередь, прикрепляются к этой осевой структуре. Мы приводили в пользу предложенной гипотезы следующие аргументы. Утолщение нуклеонем после экстракции только 0,14 М NaCl объяснялось тем, что "хвосты" ДНК, оставшиеся связанными с нуклеонемами, преципитировали вместе с гистонами на нуклеонемах в 0,14 М NaCl; 2 М NaCl удалял гистоны, и сохранившаяся ДНК уже не осаждалась на нуклеонемах. При нашей обработке препаратов ДНК не была видна в электронном микроскопе. Если мы не обрабатывали ядра ДНКазой, но экстрагировали раствором NaCl промежуточной концентрации (экстракция гистонов!), то ядра набухали, ДНК в них сохранялась, но была практически невидимой на срезах. Зато прекрасно проявлялись нуклеонемы. Очевидно, что эти аргументы не являлись решающими, но тем не менее в основных чертах предложенная модель соответствует сегодняшним представлениям. Через несколько лет после нашей публикации аналогичные данные получил Х. Буш в США.

Затем Г. Блобел (США) обнаружил, что непосредственно под ядерной мембраной располагается белковый слой, состоящий в основном из трех родственных белков с молекулярной массой около 70 кДа. Этот белковый слой был назван ламиной, а составляющие его три главные белка - ламинами. Наконец, Р. Березней и Д. Коффи (США) провели детальное исследование белкового состава ядер с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Они одновременно несколько усовершенствовали процедуру фракционирования. Ими же была введена и новая терминология. Материал ядра, остающийся после удаления ДНП, назван ядерным матриксом. В свою очередь, ядерный матрикс разделен на ламину и внутренний ядерный матрикс, соответствующий нуклеонемам.

Рис. 17. Электронно-микроскопическое исследование изолированных клеточных ядер, подвергнутых различным обработкам. а - участок изолированного клеточного ядра, фиксированного OsO₄ в растворе с низкой ионной силой; б - ядра экстрагировали 0,4 М NaCl и фиксировали OsO₄ в 0,4 М NaCl. Хроматин, лишенный гистона H1, деконденсирован и практически не виден. При этом хорошо проявляются нуклеонемы; в - ядра обрабатывали ДНКазой I и затем 2 М NaCl. Фиксация OsO₄ в 2 М NaCl. В ядре, кроме ядерной оболочки и ядрышек, видны тонкие 100 Å-фибриллы с 200 Å-гранулами, нуклеонемы; г - ядра обрабатывали ДНКазой I и затем 0,14 М NaCl. Фиксация OsO₄ в 0,14 М NaCl. Нуклеонемы выглядят как более толстые нити, видимо, в связи с налипанием на них ДНП; д - гипотетическая модель ядра. Обозначения: N - ядрышко, M - ядерная мембрана, P - поры ядерной мембраны, D - фибриллы хроматина, nn - нуклеонемы (по результатам, полученным автором и Ю. С. Ченцовым)

В последнее время мы часто используем в качестве функционального, т. е. для обозначения белкового остова хромосомы (хроматина), термин "ядерный скелет", понимая термин "ядерный матрикс" в операциональном смысле, т. е. как материал, остающийся после удаления из ядра ДНП, включая сюда не только белки, но ДНК и РНК.

Следующий важный шаг для понимания организации ядра сделали П. Кук и И. Бразел (Великобритания), которые показали, что если удалить из ядер все гистоны концентрированным солевым раствором или даже дегергентами, то ДНК не уходит из ядер, но остается в составе ядерного матрикса, образуя суперспирализованные петли. Был сделан вывод, что ДНК прикреплена в определенных точках к скелетным структурам ядра (см. выше). Аналогичные данные получены рядом других авторов.

Далее У. Лэммли (Швейцария), обработав метафазные хромосомы ионным детергентом, либо 2 М NaCl, показал с помощью электронной микроскопии, что вся ДНК хромосомы входит в состав петель длиной 30-90 т. п. н., прикрепляющихся к белковой осевой структуре хромосомы, расположенной в центре последней ("хромосомному остову") (рис. 18). После этих работ ядерный матрикс стал одной из популярных областей исследования, и появилось множество сообщений, как доказывающих, так и опровергающих его реальность. Противники ядерного матрикса аргументировали свои взгляды большой лабильностью последнего и изменчивостью его картины в электронном микроскопе. Крайняя точка зрения состоит в том, что внутренний ядерный матрикс, нуклеонемы, и остов метафазных хромосом являются результатом агрегации белков и РНК, происходящей во время экстракции 2 М NaCl. Однако в пользу "прижизненности" остова хромосом был получен целый ряд довольно убедительных данных. В частности, при окраске скелетных элементов метафазных хромосом серебром они выглядят одинаково как в исходных хромосомах, так и после их экстракции 2 М NaCl (или ДНКазой+2 М NaCl). Флюоресцирующие антитела к белкам остова также выявляют последний в нативных, не экстрагированных хромосомах.

За последние годы появилось также много работ по электронно-микроскопическому изучению тотальных препаратов метафазных хромосом. Полученные картины хорошо согласуются с представлением, согласно которому 300 Å-фибриллы ДНП отходят от неких центральных осевых структур, образуя петли (см. рис. 18). При набухании хромосом некоторые из этих петель разворачиваются, превращаясь в фибриллы типа бусин на нити.

Рис. 18. Петельная организация метафазных хромосом. а - петли ДНК в метафазных хромосомах после удаления из них гистонов. Внутри хромосомы четко виден белковый остов, к которому прикреплены петли ДНК; б - цельные метафазные хромосомы в электронном микроскопе. Видно, что они состоят из 300 Å-фибрилл, в свою очередь образующих структуры типа петель (по результатам, полученным У. Лэммли и Х. Бушем)

Сложнее обстоит дело с интерфазными ядрами, в которых окраска и серебром и антителами к белкам остова дает диффузное распределение по всему ядру. Последнее вполне естественно, если учесть деконденсацию хромосом в ядре, а также малый диаметр нуклеонем. Для выяснения "прижизненности" ядерного скелета и вынесения его функциональной роли было крайне важно установить природу белков и ДНК, входящих в его состав, и выяснить, являются ли места прикрепления ДНК к ядерному остову случайными или нет.

Специфичность ДНК в местах прикрепления к скелету^1* [125-129]. Все опыты ставятся по очень простой схеме. Клеточные ядра обрабатывают нуклеазами либо специфическими (рестриктазами), либо неспецифическими (микрококковая нуклеаза, ДНКаза I, ДНКаза II), после чего удаляют гистоны и отщепившуюся ДНК тем или иным способом (2 М NaCl, детергент, экстракция при низкой ионной силе). Иногда нуклеазная обработка повторяется после этого еще раз. В других случаях удаление гистонов 2 М NaCl или детергентом проводится перед нуклеазной обработкой. Если ядра выделены в условиях, исключающих нуклеазный гидролиз, то экстракция 2 М NaCl или детергентами удаляет только гистоны (дегистонизация), тогда как вся ДНК остается связанной с ядерным остатком.

Первые опыты по характеристике ДНК, остающейся в ядерном матриксе после переваривания рестриктазами (EcoRI и HindllI) или микрококковой нуклеазой, были проведены в нашей лаборатории С. В. Разиным и В. Л. Мантьевой. В этих опытах ядерный матрикс выделяли из L-клеток мыши путем экстракции 2 М NaCl.

По мере углубления гидролиза (это особенно четко проявляется в опытах с микрококковой нуклеазой) падает размер и уменьшается количество ДНК, удерживаемой в ядерном матриксе. Простые расчеты позволили определить, что средний размер петли ДНК, выявляемый в таких опытах, т. е. среднее расстояние между двумя соседними точками прикрепления, составляет от 60 до 70 т. п. н.

Когда размеры оставшейся прикрепленной ДНК составили около 500-1000 п. н., с этой ДНК, которую мы далее обозначаем ямДНК (ДНК ядерного матрикса), были проведены ренатурационные опыты. Ее метили и ренатурировали в присутствии избытка тотальной ДНК клетки. В опытах такого рода выясняется, с какой фракцией ДНК коренатурирует меченая ДНК, которую берут в очень малых количествах. Оказалось, что ямДНК, полученная как из интерфазных ядер, так и из метафазных хромосом, обогащена повторяющимися нуклеотидными последовательностями и представляет собою неслучайную субфракцию от тотальной ядерной ДНК.

После этого появился ряд работ других авторов, часть которых подтверждали, а другие опровергали наши выводы. Дальнейшие эксперименты позволили объяснить эти противоречия. Результаты зависят от метода выделения. Если сразу проводить удаление гистонов и отщепившейся ДНК 1-2 М NaCl или малыми концентрациями детергента (например, дийодосалицилата лития, введенного в практику Лэммли), то ямДНК представляет неслучайную фракцию. Однако если перед этим инкубировать ядра в растворах с очень низкой ионной силой (например, 1 мМ ЭДТА), то происходит полное усреднение и ямДНК становится неотличимой от тотальной ДНК. Нам кажется наиболее вероятным, что при предынкубации в растворах с низкой ионной силой происходит разрушение нативных контактов ДНК с матриксом, и этим объясняется случайный характер получаемого распределения ДНК. В пользу этой интерпретации говорят недавние опыты П. Кука и соавт. (Великобритания), которые разработали новый метод изоляции ядерного матрикса. Клетки заключали в агарозный гель, так что каждая оказывалась в своей отдельной камере. Их лизировали, промывали и в результате получали ядра, опять-таки сидящие в отдельных ячейках геля. Это препятствовало их агрегации при дальнейшей обработке. Затем ДНК подвергали нуклеазному гидролизу и удаляли отщепившуюся ДНК с помощью электрофореза при физиологических концентрациях солей. ДНК, остающаяся прикрепленной к остову, оказалась неслучайной фракцией ДНК: она была сильно обогащена транскрибирующимися последовательностями (см. разд. 3.4).

Наконец, за последние годы были выполнены работы, в которых авторы изучали места прикрепления ДНК к ядерному скелету в определенных индивидуальных областях генома. Были получены четкие данные, свидетельствующие в пользу специфичности мест прикрепления ДНК, причем в ряде случаев эти места прикрепления не зависели от процесса транскрипции (как в опытах Кука).

Первые такие данные были получены независимо У. Лэммли (Швейцария) и в совместной работе С. В. Разина (наша лаборатория) с К. Шеррером (Франция). В первой изучались места прикрепления гистоновых генов к ядерному скелету в культуре клеток дрозофилы, во второй - места прикрепления в районе α-глобиновых генов в эритробластах и эритроцитах кур. В обеих работах были обнаружены специфические места взаимодействия. Мы вернемся к этим исследованиям ниже.

Возникает вопрос, имеют ли места прикрепления ДНК к скелету функциональное значение?

Прикрепления сателлит-ной ДНК к ядерному скелету^1* [130, 131]. В опытах С. В. Разина и О. В. Яровой измеряли размеры ДНК, остающейся с ядерным матриксом при предельном переваривании ДНК микрококковой нуклеазой. Приэлектрофорезе выделенной ДНК было обнаружено два дискретных компонента, резко различающихся по своей молекулярной массе: один с размерами ~ 150 п. н., а другой с размерами ~10 т. п. н. (рис. 19).

Фрагменты длиной ~10 т. п. н. оказались весьма устойчивыми к различным обработкам. Во-первых, они были защищены от нуклеазы и в том случае, если последнюю добавляли после удаления гистонов 2 М NaCl. Во-вторых, их присутствие не зависело от условий выделения ядерного матрикса. Так, предынкубация ядер в 1 мМ ЭДТА, резко снижавшая содержание коротких фрагментов, не сказывалась на фракции длинных фрагментов.

Рис. 19. Два типа прикрепления ДНК к ядерному скелету, различающиеся по размеру защищенной белками ДНК. А - выявление двух типов защищенных от нуклеаз фрагментов в составе ядерного матрикса клеток асцитного рака Эрлиха мышей. Электрофорез ДНК в агарозном геле вели в условиях, когда выявлялся лишь один из типов ДНК, а другой или удалялся из геля, или оставался на старте. Видно, что в обоих случаях защищенные от микрококковой нуклеазы фрагменты гомогенны по размеру. УШ и УПП - участки прикрепления I и II типа; Б - существование двух типов прикреплений в ядерном матриксе из разных источников: а - печень крысы, ядра обрабатывали микрококковой нуклеазой; б- культура клеток дрозофилы (линия КС); в - эритроциты кур; в случаях б, в ядра обрабатывали ДНКазой 1. Электрофорез в 1,4%-ном агарозном геле позволяет одновременно видеть оба типа защищенной ДНК; В - тяжелый компонент ямДНК мыши представлен сателлитной ДНК, богатой А-T-парами. Электрофорез ДНК тяжелого компонента вели после обработки эндонуклеазой EcoRII. Видно, что вся ДНК переходит в серию полос с размерами, кратными 245 п. н. (субъединица сателлитной ДНК); Г-Д - полная защищенность тяжелого компонента от микрококковой нуклеазы. Электрофорез ямДНК вели в 0,7%-ном нейтральном (Г) или щелочном (Д) агарозном геле. Препараты выделены после обработки возрастающими дозами нуклеазы. Ядерный матрикс содержал 1,75% (а), 0,73 (б), 0,29 (в), 0,11 (г), 0,04 (д) и 0,02 % (е) от всей ДНК. Стрелки указывают позиции маркеров 1(10,8 и 5,4 т. п. н.). Таким образом, тяжелый компонент имеет размер 10 т. п. н. и не содержит даже одноцепочечных разрывов (по результатам, полученным С. В. Разиным и соавт.)

При равновесном ультрацентрифугировании в CsCl очищенная ямДНК с размерами около 10 т. п. н. взвешивалась в зоне с плотностью 1,69 ^г/_см³, что соответствует плотности сателлитной ДНК мыши. При переваривании рестриктазой EcoRI был получен набор дискретных фрагментов с размерами, кратными 245 п. н., что также характерно для сателлитной ДНК, состоящей из коротких повторяющихся последовательностей. Таким образом, длинные защищенные фрагменты состоят из сателлитной ДНК, хотя только небольшая ее доля входит в состав защищенной от нуклеаз фракции (~ 0,2 %). Расчеты показывают, что число таких фрагментов на ядро составляет ~ 100, т. е. около двух на хромосому. Ряд косвенных данных позволяет предположить, что эти места прикрепления располагаются на ядерной ламине. Известно, что сателлитная ДНК локализуется в области центромеров и теломеров хромосом. Учитывая все это, можно с большой вероятностью предположить, что длинные защищенные от нуклеаз участки сателлитной ДНК представляют собою места стабильного прикрепления хромосом к ядерной ламине и тем самым к ядерной оболочке в области центромеров и/или теломеров.

Прикрепление к ядерному скелету транскрибируемой ДНК^1* [127, 132-136]. Рядом авторов было найдено, что ДНК, остающаяся прикрепленной к ядерному скелету после переваривания рестриктазами или нуклеазами, обогащена транскрибирующимися последовательностями. Ядерный матрикс из эритроидных клеток обогащен глобиновыми генами, а ядерный матрикс из клеток яйцеводов - овальбуминовыми генами, но не наоборот.

Поскольку, однако, вскоре появились и прямо противоположные данные, то С. В. Разин и О. В. Яровая решили разобраться в этом вопросе более глубоко. Они нашли, что при стандартном выделении ядерного матрикса из клеток миеломы мышей, активно продуцирующей иммуноглобулин, ямДНК, остающаяся связанной со скелетными структурами после отщепления 90-95 % всей ядерной ДНК, содержит во много раз больше последовательностей, гибридизующихся с клонированными генами тяжелых цепей иммуноглобулинов, чем отщепившаяся или тотальная ДНК (рис. 20). В то же время у фибробластов мышей, в которых иммуноглобулины не синтезируются, никакого обогащения ядерного матрикса иммуноглобулиновыми генами найдено не было. Таким образом, данные о связывании транскрибирующейся ДНК с ядерным матриксом были подтверждены. Далее оказалось, что если перед выделением ядерного матрикса ядра инкубировали в растворах с низкой ионной силой, распределение иммуноглобулиновых генов между отщепленной и связанной ДНК было равномерным. Это объясняло имевшиеся в литературе противоречия. Все, следовательно, зависит от используемого метода выделения ядерного матрикса. Вероятно, предынкубация в 1 мМ ЭДТА каким-то образом разрушает ассоциацию транскрибирующейся ДНК с ядерным скелетом, т. е. именно она вызывает артефакт (а не прямая экстракция 2 М NaCl). На это указывает упомянутая выше работа Кука и сотр., которые выделяли ядерный матрикс из ядер, заключенных в агарозный гель, пользуясь только растворами с физиологической концентрацией солей. В этих опытах транскрибируемая ДНК опять-таки оказалась связанной с ядерным скелетом, что является сильным доказательством существования такой ассоциации in vivo.

Рис. 20. Демонстрация связи транскрипционно активного хроматина с ядерным скелетом. А - гибридизация меченой последовательности иммуноглобулинового гена Cμ с различными препаратами ДНК из клеток мыши; а - ДНК ядерного матрикса (ямДНК) из клеток гибридомы мыши, синтезирующей иммуноглобулин IgM (кодируемый вышеуказанным геном); выделенные ядра обрабатывали микрококковой нуклеазой и экстрагировали в 2 М NaCl; б - ямДНК из клеток SVT2; выделение ядерного матрикса велось, как в а; в - ямДНК из гибридомы; ядра перед экстракцией 2 М NaCl обрабатывали ДНКазой I и РНКазой А; г - ямДНК из клеток гибридомы; ядра после нуклеазной обработки экстрагировали раствором с низкой ионной силой и затем 2М NaCl; д - ямРНК из клеток гибридомы; ядра обрабатывали микрококковой нуклеазой, затем 2 М NaCl и далее раствором с низкой ионной силой. Цифры указывают содержание ДНК, оставшейся в препарате ядерного матрикса в процентах от тотальной ДНК- Они зависят от глубины нуклеазной обработки в каждом отдельном случае. Первая цифра (100) получалась в отсутствие нуклеазной обработки. Видно, что ямДНК гибридомы обогащена Ср генами в случае, если ядра после нуклеазного гидролиза обрабатывают 2 М NaCl, но не раствором с низкой ионной силой. В то же время предварительная обработка 2 М NaCl предупреждает диссоциацию транскрибирующейся ДНК Б - связь РНК-полимеразы II с ямДНК. Приводится общая PHK-полимеразная активность в препарате ямДНК в зависимости от процента ДНК, отщепленной от ядерного матрикса. 1 - ядра обрабатывали микрококковой нуклеазой и далее 2 М NaCl; 2 - обработка ДНКазой I и 2 М NaCl; 3 - обработка ДНКазой I + РНКазой А и 2 М NaCl; 4 - обработка микрококковой нуклеазой и раствором с низкой ионной силой; 5 - обработка микрококковой нуклеазой, раствором с низкой ионной силой и 2 М NaCl. Синтез РНК вели в растворе, содержащем 0,25 М сульфата аммония, что позволяет выявлять эндогенную РНК-полимеразу II. Активность РНК-полимеразы II выражали в пикомолях на 10й ядер (по результатам, полученным С. В. Разиным и соавт.)

Каким образом происходит ассоциация транскрибирующейся ДНК с ядерным матриксом? Участвуют ли в этом РНК, РНК-полимераза или другие факторы? Были поставлены опыты двух типов. Во-первых, ядра обрабатывали на той или иной стадии выделения ядерного матрикса РНКазой, разрушая новообразованную РНК- Это, однако, никак не сказывалось на обогащении ядерного матрикса активными генами (в данном случае - иммуноглобулиновыми) . Следовательно, взаимодействие с ядерным скелетом происходит не через новообразованную про-мРНК, хотя последняя, как это показано в большом числе работ, тоже связана с ядерным матриксом (см. гл. 5).

В другой серии опытов исследовалось распределение связанной с ДНК РНК-полимеразы II во фракции ДНК, оставшейся в ядерном матриксе после удаления той или иной части всей ДНК- Оказалось, что общая активность РНК-полимеразы ядерного матрикса оставалась неизменной при удалении от 10 до 98 % всей ДНК, и в результате ее удельная активность на единицу ДНК возрастала в 50 раз. Так было при получении ядерного матрикса экстракцией 2 М NaCl. Если же проводить предобработку ядер в растворе с очень низкой ионной силой, то общая активность РНК-полимеразы II в ядерном матриксе падала строго пропорционально снижению содержания ДНК (см. рис. 20).

Итак, очевидно, взаимодействие транскрибирующейся ДНК с ядерным скелетом вовлекает каким-то образом сам транскрипционный комплекс, включая РНК-полимеразу II. Обработка растворами с очень низкой ионной силой разрушает это взаимодействие. Отсюда, однако, не следует, что сама РНК-полимераза II взаимодействует с ядерным скелетом.

Прочно связанные белки клеточного ядра, ядерный матрикс и транскрипция^1* [137-139]. С. В. Разиным и соавт. в нашей лаборатории был сделан еще один шаг на пути понимания природы этого взаимодействия. Была установлена связь ядерного матрикса, транскрипционного комплекса и так называемых прочно связанных с ДНК белков.

Рядом авторов, начиная с работ Т. Андо и Т. Иде (Япония), было показано, что при выделении ДНК остаются прочно связанными с ней некоторые полипептиды, в основном с молекулярной массой ~ 50-60 кДа. Мы предположили, что эти белки могут играть роль в прикреплении ДНК к ядерному матриксу, и исследовали распределение прочно связанных белков между связанной с матриксом и отщепленной ДНК. Опыты велись на фибробластах мыши (L-клетках).

После разделения ямДНК (подбирали такие условия нуклеазного гидролиза, чтобы размеры ее составляли 3-5 т. п. н.) и отщепившейся ДНК их отделяли от свободных белков ультрацентрифугированием в сульфате цезия в присутствии детергента саркозила. Далее пров