Глава пятая. Работа гена и его регуляция на уровне ядерной РНК: ядерные рибонуклеопротеидные (РНП) частицы - субстрат процессинга

5.1.1* Открытие ядерных РНП-частиц, содержащих про-мРНК (гяРНК)

После того как в 1962 г. мы с В. Л. Мантьевой открыли ядерную ДНК-подобную РНК (дРНК) и затем с О. П. Самариной получили данные, что она является высокомолекулярным предшественником мРНК цитоплазмы (про-мРНК), возник вопрос о том, в каком виде она существует в клеточном ядре. Это было тем более важным, что местом процессинга про-мРНК является клеточное ядро, и там с РНК должны происходить многочисленные превращения, в том числе и открытый много позднее сплайсинг.

Именно поэтому с конца 1963 г. О. П. Самарина в нашей только что созданной лаборатории Института молекулярной биологии АН СССР развернула исследования по выяснению вопроса, в какой форме дРНК, или гяРНК (гетерогенная ядерная РНК), присутствует в ядре. О. П. Самарина имела шансы на успех, поскольку еще в нашей совместной работе 1960 г. из ядер с помощью экстракции разбавленными солевыми растворами с последующим дифференциальным ультрацентрифугированием были извлечены частицы, активно включавшие in vivo метку в РНК. Эти частицы содержали РНК, по нуклеотидному составу промежуточную между рРНК и ДНК, т. е. они явно содержали и гяРНК-

Рис. 35. ЗОБ-частицы, содержащие ядерную дРНК (гяРНК). а - выделение 30S-частиц из ядер клеток печени крысы. Клетки метили in vivo [14С]-аминокислотами (в течение длительного времени) и [³²Р]-ортофосфатом. Ядерный экстракт (рН 7,8) ультрацентрифугировали в сахарозном градиенте. В центре пробирки виден гомогенный 30S пик оптической плотности при 260 нм (ОП₂₆₀), содержащий основную массу меченой РНК и некоторое количество меченого белка; б - ультрацентрифугирование 30S-частиц, фиксированных формальдегидом, в градиенте плотности CsCl. Они собираются в один гомогенный пик с плавучей плотностью ~1,4 г/см3; 1 - [³²P], 2 - [¹⁴С] ; в - электронная микроскопия 30S-частиц (негативное контрастирование). Видны гомогенные частицы с диаметром около 200 А (по результатам, полученным О. П. Самариной и соавт.)

Было испробовано несколько схем фракционирования для очистки частиц, содержащих гяРНК, и в результате разработан очень простой метод для их выделения.

Было обнаружено два компонента: низкомолекулярный (4-6S) компонент и высокомолекулярный, весьма гомогенный ЗОБ-пик (рис. 35). Последний выявлялся не только по радиоактивности. Такой же дискретный гомогенный пик был виден и при определении УФ поглощения. Это открывало пути к выделению ЗОБ-частиц в препаративных количествах с высокой степенью чистоты. Далее была проведена первичная характеристика ЗОБ-частиц. Они содержали около 20 % РНК и 80 % белка, и их РНК по своему нуклеотидному составу точно сответствовала ДНК, т. е. это была чистая про-мРНК (или гяРНК). Первое сообщение о ЗОБ-частицах, содержащих гяРНК, появилось в 1965 г.

Ядра, приготовленные из печени крысы (метка - [³Н]-уридин или [³Р]-ортофосфат), экстрагировали большим объемом буфера (НМТ), содержащего 0,1 М NaCl, 1 мМ MgCh и 10 мМ трис-HCl, рН 6,8-7,0. При этом экстрагировались растворимые белки и РНК с нуклеотидным составом, близким к рРНК. Этот экстракт отбрасывали. Затем проводили трехкратную экстракцию тем же НМТ-раствором, но при рН 7,8. Во всех трех экстрактах выявлялась РНК, но нуклеотидному составу похожая на ДНК. Экстракты смешивали, наслаивали на 15-30 %-ный сахарозный градиент в буфере НМТ и ультрацентрифугировали ночь при 20-25 000 об/мин. После раскапывания определяли РНК по радиоактивной метке

Однако в 1964 г. из лаборатории А. С. Спирина вышла работа, в которой было описано открытие информосом, цитоплазматических частиц, содержащих мРНК, выделенных из развивающихся эмбрионов морского ежа. Эти частицы содержали мРНК и белок. Для их характеристики применен метод ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия после фиксации формальдегидом. Фиксация препятствовала диссоциации РНП в растворе с высокой ионной силой. Оказалось, что частицы имели плавучую плотность 1,4 ^г/_см³ или несколько выше, что соответствовало соотношению РНК : белок ~1:4. Это исключало возможность присутствия в них рибосом (плотность 1,5-1,56). А. С. Спириным была развита концепция, что информосомы - это форма существования мРНК в цитоплазме, инертная в отношении трансляции, где белки выступают в роли регуляторов трансляции.

Различие в свойствах между информосомами и ядерными частицами состояло в том, что первые были гетерогенны, а вторые - исключительно гомогенны. Естественно, они отличались и по своей локализации в клетке (цитоплазма-ядро). Возникла длительная дискуссия, являются ли те и другие частицами одной природы или это разные клеточные структуры. Через много лет оказалась верной вторая точка зрения. Ядерные рибонуклеопротеиды, содержащие про-мРНК (гяРНК), сокращенно про-мРНП (или гяРНП), и информосомы - это два разных класса клеточных частиц, различающиеся по своей организации, белковому составу и функциям. В нашем изложении речь пойдет исключительно о ядерных РНП.