Обсуждение

1. Для инъецирования своей ДНК в бактериальную клетку фагу P22 необходим кальций. ЭГТА образует комплексы с кальцием и тем самым препятствует размножению фага. В данном эксперименте выход чувствительных к фагу трансдуктантов повышается в результате того, что предотвращены повторные циклы развития фага на чашке. Предадсорбция необходима, чтобы фаговая ДНК могла быть инъецирована до того, как клетки окажутся на чашке с ЭГТА. Используемый фаг несет мутацию c2ts, так что высокая температура препятствует установлению репрессии. Поэтому чашки, на которые высевается трансдукционная смесь, инкубируют при 40°С.
2. ЭГТА добавляют в среду для того, чтобы предотвратить заражение чувствительных к фагу клеток каким-либо жизнеспособным фагом, оказавшимся на трансдукционной чашке.
3. Можно проводить сравнение чашек с богатой и минимальной средой, держа их против света друг над другом. Обычно ауксотрофы хорошо растут на богатой среде, но на чашке с минимальной средой дают лишь очень слабый отпечаток. В опытах с фагом P22, размножающимся в клетках Salmonella, часто используют индикаторные чашки Green (описание см. в приложении 1) (Levine, Curtiss, 1961). Колонии тех бактерий, в которых активно размножается фаг P22, приобретают на таких чашках темно-зеленую окраску. Колонии незараженных клеток (и устойчиво лизогенных клеток) оказываются бледноокрашенными. Эта среда представляет собой по существу богатую среду с индикатором рН и высокой концентрацией глюкозы. При штриховании используют чашки без ЭГТА, чтобы можно было выявить зараженные фагом колонии.
4. На чашке со штрихами не трогайте темно-зеленые зараженные колонии. Отбирайте уколом лишь хорошо изолированные слабоокрашенные колонии. В приложении 11 показано, как расположить колонии на чашке по шаблону. Чтобы не было перекрестного загрязнения ячеек, матрицы при перепечатывании иглы штампа должны быть довольно небольшими.
5. Состав 11 диагностических сред приведен в приложении 2. Каждое питательное вещество входит в состав двух таких сред. Например, серии присутствует в среде 2 (ее состав перечислен по вертикали) и в среде 10 (состав перечислен по горизонтали). Таким образом, мутант, который растет только на средах 2 и 10, нуждается, вероятно, в серине.
6. Каждый ауксотроф должен расти на двух диагностических средах (см. выше). Исключение составляют ауксотрофы с множественными потребностями - это, например, мутанты, нуждающиеся одновременно в изолейцине и валине (растут только на среде 7), и мутанты, нуждающиеся одновременно во всех ароматических аминокислотах (растут только на среде 8). Среда 11 содержит набор таких питательных веществ, которых нет в других средах. В основном это витамины. Те мутанты, которые растут лишь на среде 11, нужно проверять на способность расти в присутствии каждого из этих компонентов по отдельности. (См. приложение 2.)
7. Пипетку на 0,1 мл погружают в суспензию фага P22 (c2) (образующего прозрачные пятна) с титром 10⁸/мл. Затем этой пипеткой проводят штрих по поверхности индикаторной чашки Green и ждут, чтобы влага впиталась. После того как штрих фага высохнет, поперек него параллельными штрихами, пользуясь стерильными деревянными палочками или петлей, наносят культуры бактерий. Чашки инкубируют при 37°С.
8. Методы хранения бактериальных штаммов описаны в приложении 3. Правила обозначения мутаций и штаммов приведены во введении.

Литература

Chan R. K., Bolstein D., Watanabe T., Ogata Y., 1972. Spezialized transduction of tetracycline resistance by phage P22 in Salmonella typhimurium. II. Properties of. a high-frequency-transducing lysate, Virology, 50, 833.

Chumley F., Roth J. R., 1980. Rearrangement of the bacterial chromosome using Tn10 as a region of homology, Genetics, 94, 1.

Chumley F., Manzel R., Roth J. R., 1979. Hfr formation directed by Tn10, Genetics, 91, 639.

Kleckner N.. Roth J. R., Botstein D., 1977. Genetic engineering in vivo using translocatable drug-resistance elements. J. Mol. Biol., 116, 125.

Kleckner N., Chan R., Tye B.-K., Botstein D., 1975. Mutagenesis by insertion of a drug-resistance element carrying an inverted repetition, J. Mol. Biol., 97, 561.

Levine M., Curtiss R., 1961. Genetic fine structure of the с region and the linkage map of phage P22, Genetics, 46, 1573.

Schmid M., Roth J. R., 1980. Circularization of transduced fragments: A mechanism for adding segments to the bacterial chromosome, Genetics, 94. 15.