Методика

Транспозиция Tn10

1. Смешайте фаг P22 (лизат клетки NK337) и клетки Salmonella дикого типа (штамм LT2) в таком соотношении, чтобы множественность заражения была меньше единицы. Инкубируйте, чтобы провести адсорбцию фага. Вылейте смесь на чашки со средой LB + тетрациклин (20 мкг/мл) + ЭГТА (10 мМ). Высевайте столько клеток, чтобы получить около 100-200 колоний в расчете на одну чашку (см. методику 5). Приготовьте 15 таких чашек на одну группу. Инкубируйте чашки при 40°С до тех пор, пока не появятся колонии (около 24-36 ч).

Выявление ауксотрофов

2. Каждую трансдукционную чашку перепечатайте на чашку LB + тетрациклин (20 мкг/мл) + ЭГТА и на чашку E + тетрациклин (10 мкг/мл). Инкубируйте при 37°С.

3. Сравните чашки-реплики с богатой средой и с минимальной средой. Выявив колонию, выросшую на богатой среде, но отсутствующую на чашке с минимальной средой, отберите ее уколом с чашки с богатой средой и рассейте штрихом до отдельных колоний на чашке Green+ тетрациклин (без ЭГТА). Такие чашки с рассевом инкубируйте при 37°С.

Классификация ауксотрофов

4. Со штриха каждого потенциального ауксотрофа отберите уколом слабоокрашенную (чувствительную к фагу) колонию. По шаблону перенесите все такие колонии на отдельные ячейки на чашке Green + тетрациклин + ЭГТА. Инкубируйте чашки при 37°С.

5. Перепечатайте засеянную по шаблону чашку (чашки) с потенциальными ауксотрофами на 11 чашек с диагностическими средами (см. приложение 2), на чашку с минимальной средой и на чашку со средой Green + тетрациклин + ЭГТА. Все чашки инкубируйте при 37°С в течение 24-36 ч. Исходные чашки сохраните.

6. Просмотрите чашки-реплики. Определите вероятные потребности каждого ауксотрофа. Проведите повторную очистку

ауксотрофов, рассеяв клетки с чашки-реплики с богатой средой (Green + тетрациклин + ЭГТА) до отдельных колоний. Затем из полученных отдельных колоний каждого ауксотрофа засейте пробирки по 2 мл жидкой культуры. Инкубируйте со встряхиванием при 37°С.

Проверка чувствительности к фагу и пищевых потребностей мутантов

7. Чтобы проверить, чувствительность к фагу, нанесите штрихи культур каждого из потенциальных ауксотрофов на чашку Green + тетрациклин (без ЭГТА) и поперек этих штрихов нанесите штрих фага P22. На отдельных чашках с минимальной средой разотрите 0,1 мл каждой культуры. На эти чашки добавьте по несколько кристалликов того необходимого питательного вещества, которое было выявлено с помощью диагностических сред.

8. Просмотрите результаты тестов на чувствительность к фагу и тестов с кристалликами питательных веществ. Все те ауксотрофы, которые чувствительны к фагу и которые отвечают на идентифицированное питательное вещество, можно закладывать на хранение. Приготовьте столбик с культурой для длительного хранения и занесите штамм в журнал.