Обоснование и план эксперимента

В этом эксперименте транспозон Tn10 (сообщающий устойчивость к тетрациклину) вводится в клетки Salmonella с помощью специально сконструированного фага P22 (Chan et al., 1972; Kleckner et al., 1975). Такой фаг содержит Tn10, а также несет мутации, блокирующие репликацию фага (12^-), лизис (13^-), репрессию (c2ts) и интеграцию (int^-). Эти мутации фага препятствуют передаче донором реципиенту устойчивости к тетрациклину (Tet^R) любым обычным способом (т. е. посредством лизогенизирования или образования плазмиды). Поскольку в фаговой ДНК нет участков, гомологичных хромосоме реципиента, то наследование элемента Tn10 в результате обычной гомологичной рекомбинации также происходить не может. При таких условиях проводится отбор клеток, устойчивых к тетрациклину. Реципиент должен приобрести элемент Tn10 в результате необычной, незаконной рекомбинации, т. е. в результате транспозиции его из хромосомы фага P22 в хромосому реципиента. Каждая колония трансдуктанта Tet^R представляет собой результат одного независимого акта транспозиции, и каждый трансдуктант содержит одну копию ДНК транспозона ТпЮ в каком-то своем сайте хромосомы. При используемых условиях такие трансдуктанты Tet^R возникают с частотой 1 на 10⁵ зараженных клеток.

В реальном эксперименте мутант P22 Tc10, т. е. множественный мутант фага P22, несущий в своем геноме Tn10 (Chan et al., 1972), смешивают с клетками и высевают на чашки с богатой средой, содержащей тетрациклин. Образовывать колонии способны лишь те клетки реципиента, которые получили Tn10 (путем транспозиции). После того как эти колонии вырастут, их перепечатывают на чашки с богатой средой [LB (бульон Луриа - Бертани) + тетрациклин] и на чашки с минимальной средой (E + тетрациклин). Ауксотрофы выявляют, сравнивая эти чашки-реплики. Используемый в таком скрещивании фаг получают индукцией лизогенного штамма NK337, как это описано в методике 5. Там же описано, как определять титр этого дефектного фага.