Обсуждение

1. (Этап 2); среда для картирования делеций содержит низкую концентрацию гистидина, так что реципиенты могут расти в течение нескольких делений. В результате повышается количество трансдуктантов, а тем самым и разрешение картирующих скрещиваний. В качестве положительного контроля, показывающего эффективность применяемых фаголизатов, использован реципиент pur B (или pur F). В качестве негативного контроля использован реципиент с делецией his-3050, в результате которой удаляется весь his-оперон. Такие картирующие скрещивания обладают повышенной чувствительностью, так как для трансдукции использован мутант фага P22. Этот мутант несет мутацию (HT), которая сильно повышает вероятность включения материала клетки-хозяина в головки фага (Schmieger, 1972). В лизате такого мутанта около половины фаговых частиц содержат ДНК клетки-хозяина (Susskind and Botstein, 1978). Те чашки, которые будут использоваться в скрещиваниях такого типа, полезно предварительно инкубировать в течение ночи при 37°С. Они подсохнут, и капли фага быстрее впитаются, что позволит избежать слияния нанесенных на чашку капель.
2. (Этап 3); если в пятнах на контрольной чашке нет колоний, то пятна скрещивания можно считать положительными (т. е. указывающими на то, что рекомбинация происходит), даже если в них оказалось лишь по одной колонии. Обычно такой слабый ответ нуждается в подтверждении, для чего проводят скрещивание на целой чашке (0,1 мл суспензии фага и 0,1 мл полностью выросшей жидкой культуры растирают по всей селективной чашке).

Литература

Hartman P., Hartman Z., Stahl R., Ames B. N., 1971. Classification and mapping of spontaneous and induced mutations in the histidine operon of Salmonella, Adv. Genet., 16, 1.

Hoppe I., Johnston H. M., Biek D., Roth J. R., 1979. A refined map of the hisG gene of Salmonella typhimurium, Genetics, 92, 17.

Schmieger H., 1972. Prage P22 mutants with increased or decreased transducti on abilities, Mol. Gen. Genet., 119, 75.

Susskind M. M., Botstein D., 1978. Molecular genetics of bacteriophage P22 Microbiol. Rev., 42, 385.