Обоснование и план эксперимента

Пул гибридных фагов λ был создан в результате введения случайных EcoRI-фрагментов ДНК S. typhimurium в вектор λgt7. Таким образом было получено 250000 независимо образованных гибридов Фаг λ не способен заражать клетки Salmonella, но гены Salmonella экспрессируются в клетках E. coli. Заражая клетки E. coli His^- такими фагами, можно провести тест на комплементацию. Чтобы провести отбор лизогенных бактерии, образуют двойные лизогены, используя фаг-помощник λgt4-lac5. Этот фаг несет все гены, необходимые для лизогенизации. Он содержит также ген β-галактозидазы E. coli, так что его можно отличить от всех используемых гибридов. Этот фаг - помощник интеграции несет также температурочувствительную мутацию cI857 в гене λ-репрессора, что позволяет получать из лизогенных бактерий гибридный фаг, проводя индукцию температурой. Отбор лизогенных бактерий проводят, заражая клетки His^- смесью гибридных фагов и фага - помощника интеграции и высевая их на минимальные чашки без гистидина. Колонии, вырастающие на этих чашках, образованы клетками, которые содержат гибридный фаг, комплементирующий данный дефект клетки-хозяина. Эти клетки или содержат гибридный фаг, супрессирующий дефект His^-, или просто являются ревертантами. Поскольку используются большие количества фага, то и в том и в другом случае колонии будут, вероятно, содержать фаг - помощник интеграции и один или несколько гибридных фагов. Чтобы отличить супрессию в результате комплементации от реверсии, из колоний, выросших на минимальных чашках, выделяют фаг. Для этого проводят термоиндукцию культуры, т. е. подращивают ее в течение короткого времени при 42°С. Гибридный фаг из этих клеток можно отличить от фага - помощника интеграции, проведя высев на чашки с Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозидом) - хромогенным субстратом β-галактозидазы. Гибриды образуют бесцветные бляшки, а помощник интеграции - голубые. Затем можно провести тест на комплементацию гибридного фага с исходным мутантом, а также и с другими мутантами.

Литическая комплементация гораздо проще. Клетки His^- заражают пулом гибридных фагов и высевают на минимальные чашки без гистидина. Тот фаг, который комплементирует клетки His^-, должен бы образовывать бляшки. Однако все клетки заражены и потому не могут расти и образовывать газон. В результате если проводить высев обычным образом, то должны бы образоваться бляшки (прозрачные пятна) на прозрачной чашке. Поэтому важно, чтобы на такие чашки высевалось очень много клеток - столько, чтобы чашка слегка замутилась. Тогда можно будет ясно разглядеть прозрачные бляшки. Так как во время литического цикла происходит активная транскрипция генома фага λ, то желательно, чтобы клонированная последовательность, попавшая в центральную область генома фага, транскрибировалась и с какого-нибудь фагового промотора. В этом случае встроенные гены могут экспрессироваться во время литического цикла инфекции, даже если при них нет собственного промотора. Поэтому фаг, выявленный на основании результатов комплементации при литической инфекции, может быть и неспособным комплементировать в двойном лизогене. Поскольку бляшка образуется в результате нескольких последовательных циклов инфекции, то реверсии клеток, как правило, не приведут к образованию бляшек некомплементирующим фагом.