Методика

1. Отдельной колонией E. coli RD100 (hisB463) засейте 40 мл минимальной среды с гистидином и мальтозой (без глюкозы). После того как культура вырастет почти до насыщения, отцентрифугируйте клетки и ресуспендируйте в 1/10 объема 10 мМ MgSO₄, чтобы получить концентрацию 10¹⁰ клетка/мл. Вырастите также 40 мл культуры BNN45 в бульоне TYM для обычного высева фага λ на чашки (см. методику 1).

Отбор лизогенов

2. Высейте пул гибридных фагов λ на чашки с газоном E. coli His^- и проведите отбор лизогенов. В качестве помощника интеграции используйте фаг λgt4-lac5. Приготовьте следующие чашки для отбора:

10⁸ гибридов фага λ и 2·10⁹ λgt4-lac5 на одну минимальную чашку без гистидина.

10⁷ гибридов фага λ и 2·10⁹ λgt4-lac5 на одну минимальную чашку без гистидина.

10⁶ гибридов фага λ и 2·10⁹ λgt4-lac5 на одну минимальную чашку без гистидина.

Высевайте по 5·10⁸ клеток на чашку. Инкубируйте при 32°С, так как помощник интеграции несет температурочувствительную мутацию cI857. Высевайте на чашки также по отдельности гибриды фага λ, фаг λgt4-lac5 и клетки His^-, чтобы выявить наличие загрязнения или ревертантов.

Литический отбор

3. Высейте на чашки с газоном E. coli His^- пул гибридных фагов λ и проведите отбор фагов, дающих литическую комплементацию. Разлейте чашки, не содержащие бромистого этидия в верхнем агаре. Высейте 2·10⁶, 2·10⁵, 2·10⁴ гибридных фагов κ и по 2·10⁹ клеток на чашку. Используйте, конечно, чашки с минимальной средой М9 и минимальный верхний агар М9 без гистидина. Инкубируйте при 37°С.

Просмотрите результаты эксперимента по комплементации (литической и лизогенной). Проведите очистку бляшек четырех фагов, которые предположительно дают литическую комплементацию, на чашках LB (неселективная среда). Отберите уколом четыре колонии лизогенных бактерий, проявляющих комплементацию, и засейте ими по 1 мл бульона LB. Выращивайте при 32°С до тех пор, пока культуры слегка не помутнеют (до 10⁷-10⁸ клетка/мл). Растите культуру в течение 2 ч при 42°С, чтобы индуцировать лизогенные бактерии. Рассейте получившиеся культуры штрихом до отдельных бляшек на чашках LB. Для газона добавьте на эти чашки LB по 20 мкл клеток RD100 или BNN45. В мягкий агар, используемый для чашек, на которых рассеваете проявившие лизогенную комплементацию фаги, добавьте 40 мкл раствора Xgal (40 мг/мл). Это делается для того, чтобы выявить фаг - помощник интеграции (λgt4-lac5).

Перепроверка комплементации

4. Проведите перепроверку клонов, которые по предварительным данным дают комплементацию, на минимальных чашках М9. Отберите уколом бляшки с чашек LB и ресуспендируйте каждую в 100 мкл среды для разведения фага λ. Выберите четыре фага (бесцветные бляшки) из полученных после отбора лизогенных бактерий и четыре фага из полученных после литического отбора. Рассейте штрихом все эти восемь фагов на одну минимальную чашку М9 с клетками His^- и с 2·10⁹ частиц фага - помощника интеграции. Остаток используйте для получения препаратов фагов на чашках LB с агарозой. После инкубации в течение 6 ч при 37°С соберите с чашек урожай. Наливайте в чашку по 5 мл среды для разведения фага λ и оставьте на ночь при 5°С.

Соберите препараты комплементирующих фагов и храните их в закупоренных аналитических пробирках с несколькими каплями хлороформа.

Просмотрите результаты перепроверки комплементации.

Быстрое выделение ДНК фага λ из препарата фага (гибридного и комплементирующего)

5. Следуйте методике 11-II быстрого выделения ДНК фага λ. Используйте препараты, полученные на чашках с агарозой.

Определение длин рестрикционных фрагментов ДНК гибридных фагов

6. Расщепите по 5 мкл каждой ДНК рестриктазой Eco RI и нанесите на гель 0,7%-ной агарозы. Проведите электрофорез в течение 6 ч при 50 В. Остатки препаратов быстрых лизатов фага сохраните, чтобы получить потом на чашках большие количества фагов.

Препараты с чашек

7. Приготовьте по 20 чашек каждого из трех - шести фагов, выбранных на основе результатов электрофореза в геле (см. выше). Чашки инкубируйте в течение 6 ч, после чего налейте в них по 5 мл среды для разведения фага λ при 5°С.

Сбор препаратов фага

8. Для выделения фага λ следуйте методике 4. Используйте минимальное количество пробирок. Препарат фага с 20 чашек можно уместить в две центрифужные пробирки объемом по 45 мл.

Очистка фага в растворе CsCl

9. Ресуспендируйте осажденный фаг в суммарном объеме 1 мл (по 0,5 мл на каждую из двух пробирок). Следуйте методике 4-1А для осаждения через ступенчатый градиент.