Обоснование и план эксперимента

В бляшке фага λ содержится много фага и фаговой ДНК. Фаг и ДНК можно прямо из бляшек перенести на нитроцеллюлозу, если наложить на чашку сухой нитроцеллюлозный фильтр. После денатурации перенесенной на фильтр ДНК она оказывается уже готовой для гибридизации. Таким способом можно проверять до 25000 бляшек на одной чашке. Связанную с фильтрами денатурированную ДНК гибридизуют с ДНК, меченной ³²Р с помощью ник-трансляции. После этого фильтр промывают и экспонируют с ним рентгеновскую пленку. Пятна почернения на пленке соответствуют гибридизующимся клонам.

Основная методическая трудность - это сориентировать рентгеновскую пленку относительно чашки. Для этого мы пользуемся специальным ориентирующим фагом. Этот фаг содержит фрагмент ДНК, способный гибридизоваться с определенной меченной ник-трансляцией ДНК (pBR322), а также несет ген β-галактозидазы E. coll. В среду на чашке добавляется Xgal, так что бляшки ориентирующего фага оказываются голубыми. Кроме того, ориентирующий фаг гибридизуется с ДНК-зондом pBR322. На чашку ориентирующий фаг можно нанести случайным образом, добавив его при высеве гибридного фага, а можно нанести капли его на определенные участки чашки. Уколом отбирают бесцветные бляшки в том месте, где была обнаружена гибридизация, очищают их и проверяют, гибридизуются ли они с меченой ДНК.