Методика

1. Проведите ник-трансляцию примерно 0,5 мкг ДНК (методика 22).

Приготовление чашек для гибридизации in situ

2. Каждой группе нужно приготовить по восемь чашек LB, на которые в мягком агаре LB высеяно 10⁴÷10³ фаговых частиц. Инкубируйте при 37°С. Пользуйтесь чашками, разлитыми за два дня до эксперимента. На каждую чашку высевайте по 20 мкл клеток BNN45 для газона. При высеве добавьте на каждую чашку по 10-20 мкл фага λgt5-lac5, pBR322. Можно вместо этого платиновой проволочкой нанести капли препарата данного фага на уже готовую чашку. На чашки добавьте также Xgal (внесите в мягкий агар 40 мкл раствора Xgal 40 мг/мл в демитилсульфоксиде).

Гибридизация бляшек на фильтре

3. Возьмите две чашки, на которых оказалось около 10⁴ бляшек, и две чашки примерно с 10³ бляшек. В каждой группе отберите по две самые хорошие чашки с 1·10³-3·10³ бляшек и по две чашки примерно с 104 бляшек. Следуйте методике 21-II.

Непременно надпишите каждый фильтр и пометьте его ориентацию. Поместите фильтры в герметизируемый мешочек с денатурированной ник-транслированной ДНК, как указано в методике 23, и заварите его. Обязательно наденьте двойные перчатки, защитные очки и пластиковый фартук.

Экспозиция пленки с фильтром

4. Надрежьте мешочек, в котором проводили гибридизацию, по заваренному месту и слейте гибридизационную смесь. Разрежьте мешочек и выньте фильтр. Промойте фильтр, как описано в методике 23. Гибридизационную смесь поместите в холодильник и храните для повторного использования. Обязательно наденьте двойные перчатки, защитные очки и пластиковый фартук. Высушите фильтр. Оберните его пластиковой пленкой, чтобы не загрязнить кассету и усиливающий экран. Экспонируйте фильтр с рентгеновской пленкой (см. методику 24).

Проявите пленку, экспонированную с фильтром

5. Наложите исходную чашку с бляшками на пленку. Отберите уколом платиновой проволочкой до восьми бляшек с той области чашки, в которой проявилась гибридизация. Рассейте их методом штрихования сверху до отдельных бляшек, используя по ¹/₈ чашки для рассева каждой бляшки. Переколите таким образом до четырех обнаруживших гибридизацию областей. Инкубируйте при 37°С в течение по крайней мере 6 ч. Переколите отдельные бляшки по шаблону, инкубируйте в течение ночи при 37°С.

Гибридизация бляшек на фильтре II

6. Приготовьте новый фильтр-реплику с тех бляшек, которые были рассеяны и переколоты по шаблону. После отжига поместите этот новый фильтр-реплику в новый мешочек, добавьте в него гибридизационную смесь и заварите его. Обязательно наденьте двойные перчатки, защитные очки и пластиковый фартук. Начинать все это нужно в начале рабочего дня. Чашку с бляшками поместите в холодильник.

Экспонирование фильтра с пленкой

7. После гибридизации фильтра II в течение по крайней мере 6 ч выньте фильтр, промойте его, промокните насухо и оберните пластиковой пленкой. Экспонируйте с ним рентгеновскую пленку. При необходимости можно использовать кассету, которой не пользовались для полосок, отпечатанных с геля. Экспонируйте около 6 ч.

Проявление пленки, экспонированной с фильтром II, и получение препаратов фага на чашках с агарозой

8. Примерно через 6 ч проявите пленку, экспонированную с фильтром II. Выявите бляшки, соответствующие гибридизации. Отберите их уколом и приготовьте препараты фага на чашках. Используйте чашки с агарозой и следуйте методике 11-II быстрого выделения фаговой ДНК. Выращивайте по одной чашке каждого фага (от одного до шести). После выращивания в течение 6 ч налейте на чашку 5 мл среды для разведения фага λ и инкубируйте при 5°С в течение 2-12 ч. Если позволит время, то, используя быстрый метод, выделите ДНК из этих препаратов фага.

Определение длин рестрикционных фрагментов ДНК гибридных фагов λ

9. Расщепите по 5 мкл каждой ДНК рестриктазами EcoRl и Hind III и нанесите на гель 0,7%-ной агарозы. Проводите электрофорез в течение 6 ч при 50 В. Остатки тех препаратов фага, из которых быстрым методом были выделены ДНК, сохраните, чтобы вырастить фаг на чашках в большом количестве.

Препараты с чашек

10. Приготовьте по 20 чашек каждого из трех - шести фагов, выбранных на основании результатов электрофореза в геле. Выращивайте в течение 6 ч. Налейте на чашки по 5 мл среды для разведения фага λ при 5°С.

Сбор фага с чашек

11. Следуйте методике 2 выделения фага λ вплоть до стадии центрифугирования. Используйте минимальное число пробирок. Препарат с 20 чашек можно уместить в две центрифужные пробирки объемом 45 мл.

Очистка фага в растворе CsCl

12. Ресуспендируйте осажденный фаг в суммарном объеме 1 мл (по 0,5 мл на каждую из двух пробирок). Следуйте методике 4-IA очистки в ступенчатом градиенте.

13. Продолжайте очистку фага.