Обсуждение

I. Для газона можно использовать клетки любого штамма, на котором образуются четко выраженные бляшки. Многие штаммы E. coli устойчивы к заражению фагом λ (они обозначаются как /λ). Большинство амбер-мутаций фага λ может супрессироваться супрессором supE (su2⁺), который присутствует в штамме C600. Имеющаяся во многих штаммах фага λ мутация λSam7 супрессируется супрессором supF (su3⁺), который есть в штамме BNN45 в дополнение к супрессору supE. Белок бактерии, на котором адсорбируется фаг λ, кодируется геном, входящим в состав индуцируемого мальтозой mal-оперона. Поэтому клетки, выращенные на мальтозе (в среде TYM), очень хорошо адсорбируют фаг λ. Однако при высеве фага чашки не должны содержать мальтозы, так как вторичная адсорбция на чашке приводит к снижению конечного выхода фага. Стационарную культуру можно хранить в растворе MgSO₄. Если же высев проводят сразу после ее получения, то можно использовать непосредственно выращенную культуру. Культуру можно хранить в MgSO₄ при 5°С до двух недель. Однако эффективность высева оказывается наибольшей, а морфология бляшек оказывается более однородной, если пользоваться клетками, полученными не более чем за 1 сутки до опыта. Высев фага P22 оказывается наилучшим при использовании экспоненциальных культур Salmonella, хранившихся на холоду не более 36 ч.

II. А. Фаг рассеивают штрихом точно так же, как культуры бактерий. Используйте для этого либо чашку для фага λ, либо чашку LB. На чашках для фага λ бляшки получаются большего размера. Размер бляшек увеличивается также, если использовать для газона меньше клеток. Поскольку предадсорбция фага не проводится, то акты, инфицирования, приводящие к образованию бляшек, могут быть сильно растянуты во времени. Поэтому размер бляшек может варьировать. В данном случае вариабельность размера бляшек не обязательно указывает на гетерогенность генотипа фага. Этот метод очень удобен для тех, у кого мало опыта, однако он имеет тот недостаток, что на каждой чашке можно провести очистку лишь одного фага.

Б. Эта методика сложнее, чем методика А, но она обладает тем преимуществом, что на одной чашке можно рассеять штрихом одновременно несколько фагов. Рассев штрихом проводить легче, если сделать верхний агар более твердым. Для этого чашки следует охладить.

III. Обычно бляшки становятся видимыми примерно через 6 ч. Как только клетки достигают стационарной фазы, бляшки перестают увеличиваться. Фаг, однако, продолжает диффундировать в слое верхнего агара со скоростью около 1 см/сутки. Поэтому следует отбирать уколом наиболее изолированные бляшки сразу после того, как они становятся хорошо различимыми, чтобы исключить возможность загрязнения частицами из соседних бляшек. Рекомендуется проводить повторную очистку бляшек, так как нельзя быть уверенным, что бляшка совсем не загрязнена какими-либо примесями.

IV. Обычно, чтобы получить разведение 1:100, вносят 0,1 мл в 9,9 мл среды для разведения фага λ, или 10 мкл в 0,99 мл такой среды. Можно развести фаг и в 1000 раз. Для этого вносят 1 мкл препарата в 1 мл среды для разведения фага Я. При хранении препарата фага в течение нескольких месяцев титр в нем может упасть более чем в 10 раз. Поэтому при испытании старых препаратов желательно высевать также и несколько меньших разведений фага. Удобно помечать чашки, надписывая на них общие данные о высеянном разведении. Зарегистрируйте, например, просто показатель степени разведения и высеянный объем. Так, если высеяли 0,05 мл разведения 10^-7, то напишите на чашке 7/0,05.