Обсуждение

I. А. Как фаг λ, так и фаг P22 имеют плотность около 1,5 г/мл. Точная плотность фага λ зависит от того, сколько в нем содержится ДНК. С увеличением количества ДНК в частице плотность фага возрастает. Ступенчатый градиент состоит из двух слоев раствора CsCl с плотностями 1,6 и 1,4 г/мл. Осаждающийся при центрифугировании фаг задерживается на границе между этими растворами. После того как растворы наслоены, следует отметить границу между ними, нанеся черту снаружи пробирки. Это поможет определить положение полосы фага после центрифугирования. Плотность белковых примесей составляет около 1,3 г/мл, и в растворе CsCl с плотностью 1,4 г/мл они должны всплывать. Плотность ДНК и РНК, однако, больше плотности фага, и поэтому они могут оказаться размазанными по всеми градиенту.

Б. Это обращенный ступенчатый градиент, в котором фаг всплывает к границе между слоями с разными плотностями. При смешивании суспензии фага в растворе CsCl с плотностью, равной плавучей плотности фага (ρ=1,5), с равным объемом насыщенного раствора CsCl получается раствор с плотностью 1,7 г/мл. Примеси ДНК (ρ=1,7) и РНК (ρ=1,9) должны отделяться от всплывающего фага.

II. При использовании этого метода достигается хорошая очистка, но требуется более продолжительное центрифугирование. Примеси РНК, ДНК и некоторых белков за 16 ч равновесия не достигают и оказываются распределенными по всему градиенту. Данный метод обладает тем преимуществом, что градиент, в котором фаг концентрируется при равновесной плотности, оказывается гораздо более пологим, чем описанный выше ступенчатый градиент. Поэтому если препарат фага гетерогенен и содержит частицы с ДНК разной длины, то после центрифугирования можно обнаружить не одну, а несколько полос фага.

Слабую полосу фага лучше всего наблюдать, направив на пробирку сверху коллимированный пучок света от осветителя для микроскопа. Поломы лучше выявляются, если за пробиркой поместить черный экран.

Burst size

Оп! В лаборатории может взрываться (burst) и лопаться многое, в том числе и эксперименты. Однако "burst size"^* - это просто число фаговых частиц, получающихся в отдельной клетке бактерии-хозяина.

^* (Непереводимая игра слов: burst - взрываться, a burst size - выход фага.)