НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

Методика 5. Транспозиция элемента Tn10

I. Получение дефектного трансдуцирующего фага из штамма NK 337

Дефектный трансдуцирующий фаг с транспозоном Tn10 получают при индукции штамма NK337. Этот сложный лизоген (см. обсуждение) крайне нестабилен, и его следует хранить при -70°С или в лиофилизированном виде.

  1. Рассейте штамм NK337 до отдельных колоний, проверьте его температурочувствительность. (Чувствительность к температуре свидетельствует о наличии профага с мутацией c2ts.) Чувствительность к температуре проверяют, сравнивая эффективность образования колоний при 30 и при 42°С.
  2. Вырастите ночную культуру штамма NK337 объемом 30 мл при комнатной температуре (ниже 30°С).
  3. Разведите культуру, перенеся все 30 мл в 1500 мл супербульона (см. приложение 1). Культуру в супербульоне вырастите до плотности ~3·108 клетка/мл (OD650=0,5; в качестве контроля обязательно используйте супербульон) при температуре 30°С или ниже.
  4. Перенесите культуру в качалку в водяной бане на 39°С.
  5. Инкубируйте со встряхиванием в течение 3 ч, или пока культура не лизирует.
  6. Добавьте хлороформ (20 мл), перетрясите, подождите и опять перетрясите. (Клетки в супербульоне, по-видимому, плохо лизируют под действием хлороформа. Повторение в течение 15 мин циклов встряхивания и нескольких минут покоя приводит, как кажется, к хорошему результату).
  7. Проведите низкоскоростное центрифугирование, чтобы удалить обломки клеток (иногда оказывается необходимым провести несколько повторных центрифугирований). Соберите надосадочную жидкость. Большинство препаратов лизирует хорошо и становится прозрачными уже после первого центрифугирования.
  8. Добавьте отростки фага (методику см. ниже).
  9. Сконцентрируйте частицы фага, проведя высокоскоростное центрифугирование (см. методику 2).
  10. Титр фага можно определить, проведя трансдукцию штамма TR4368 (his-644 [P22 sie A27]) к TetR. Такая трансдукция дает оценку числа функциональных частице элементом Tn10. Этот элемент можно перенести с помощью трансдукции в профаг реципиента потому, что с обеих сторон от Tn10 имеются гомологичные профагу последовательности фаговой ДНК. Титр частиц примерно в 103 раз превышает число трансдуктантов TetR, которые обнаруживаются в таком опыте.
  11. После добавления отростков фага (см. ниже) из 1,5 л культуры получается ~5·1012 фаговых частиц.
предыдущая главасодержаниеследующая глава






Генетики нашли в ДНК мужчин следы древней «войны кланов»

Европейцы и азиаты посветлели независимо друг от друга

Современные высшие растения возникли в результате сдвига экспрессии генов

Генетики нашли «семью», состоящую из 13 миллионов человек

Прочитали рекордный по длине геном мексиканской амбистомы - 32 миллиарда пар нуклеотидных оснований

ДНК человека, умершего в 1827 году, восстановили без его останков

Генетики изучили жителей Новой Гвинеи

Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru