Методика 5. Транспозиция элемента Tn10

I. Получение дефектного трансдуцирующего фага из штамма NK 337

Дефектный трансдуцирующий фаг с транспозоном Tn10 получают при индукции штамма NK337. Этот сложный лизоген (см. обсуждение) крайне нестабилен, и его следует хранить при -70°С или в лиофилизированном виде.

1. Рассейте штамм NK337 до отдельных колоний, проверьте его температурочувствительность. (Чувствительность к температуре свидетельствует о наличии профага с мутацией c2ts.) Чувствительность к температуре проверяют, сравнивая эффективность образования колоний при 30 и при 42°С.
2. Вырастите ночную культуру штамма NK337 объемом 30 мл при комнатной температуре (ниже 30°С).
3. Разведите культуру, перенеся все 30 мл в 1500 мл супербульона (см. приложение 1). Культуру в супербульоне вырастите до плотности ~3·10⁸ клетка/мл (OD₆₅₀=0,5; в качестве контроля обязательно используйте супербульон) при температуре 30°С или ниже.
4. Перенесите культуру в качалку в водяной бане на 39°С.
5. Инкубируйте со встряхиванием в течение 3 ч, или пока культура не лизирует.
6. Добавьте хлороформ (20 мл), перетрясите, подождите и опять перетрясите. (Клетки в супербульоне, по-видимому, плохо лизируют под действием хлороформа. Повторение в течение 15 мин циклов встряхивания и нескольких минут покоя приводит, как кажется, к хорошему результату).
7. Проведите низкоскоростное центрифугирование, чтобы удалить обломки клеток (иногда оказывается необходимым провести несколько повторных центрифугирований). Соберите надосадочную жидкость. Большинство препаратов лизирует хорошо и становится прозрачными уже после первого центрифугирования.
8. Добавьте отростки фага (методику см. ниже).
9. Сконцентрируйте частицы фага, проведя высокоскоростное центрифугирование (см. методику 2).
10. Титр фага можно определить, проведя трансдукцию штамма TR4368 (his-644 [P22 sie A27]) к Tet^R. Такая трансдукция дает оценку числа функциональных частице элементом Tn10. Этот элемент можно перенести с помощью трансдукции в профаг реципиента потому, что с обеих сторон от Tn10 имеются гомологичные профагу последовательности фаговой ДНК. Титр частиц примерно в 10³ раз превышает число трансдуктантов Tet^R, которые обнаруживаются в таком опыте.
11. После добавления отростков фага (см. ниже) из 1,5 л культуры получается ~5·10¹² фаговых частиц.