II. Добавление отростков к головкам фага P22

Многие частицы фага, полученные после индукции клеток, лизогенных по фагу P22, оказываются без отростков. Отростки можно присоединить к таким частицам, пользуясь приведенной ниже методикой, в основе которой лежит метод Израиля и др. (Israel et al., 1967).

Эта методика включает получение лизата мутанта фага, дефектного по головке. Фаг этот песет также мутацию 13^-, которая предотвращает лизис и способствует накоплению больших количеств отростков. Для получения хвостовых отростков фага Р22 используется штамм P22-503 (с 1-7 12amN114 73amH101), а в качестве его хозяев - штаммы Salmonella TR248 (cysA1349 am hisC527am) и TR251 (cisA 1349am hisC527am supD [sul⁺]).

А. Получение хвостовых отростков

1. Вырастите препарат фага P22-503 на клетке-хозяине TR251 (методики 2 и 3).
2. Проверьте концентрацию ревертантов, высевая полученный препарат фага на штамм TR251 (пермиссивный для амбер-мутантов) и на штамм TR248 (непермиссивный для амбер-мутантов).
3. Вырастите 2 л культуры TR248 в бульоне LB при 37°С до плотности ~2·10⁸ клетка/мл.
4. Заразите фагом P22-503 с множественностью заражения 5 фагов на клетку.
5. После заражения инкубируйте в течение 90 мин при 37°С со встряхиванием.
6. Осадите зараженные клетки цетрифугированием (6000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируйте их в физиологическом растворе (¹/₁₀₀ исходного объема).
7. Лизируйте клетки, добавив хлороформ и интенсивно встряхивая.
8. Обработайте ДНКазой (10 мкг/мл) в течение 10 мин при комнатной температуре.
9. Отцентрифугируйте препарат в течение 15 мин при 5000 об/мин, чтобы удалить обломки клеток.
10. Чтобы удалить все целые фаговые частицы, центрифугируйте в течение 2 ч при 17000 об/мин. Проведите повторное центрифугирование. Каждый раз собирайте надосадочную жидкость и отбрасывайте осадок.
11. Проверьте надосадочную жидкость на содержание в ней интактного фага, высеяв ее на газон TR251. Фага должно содержаться менее чем 10⁴ БОЕ/мл.

Б. Присоединение хвостовых отростков к головкам

Смешайте суспензии отростков и головок фага и инкубируйте в течение 2 ч при 30°С. Проводя высев, следите за нарастанием титра фага. Чтобы насытить ~5·10¹² головок, полученных при индукции культуры NK337 объемом 1,5 л, используйте препарат отростков фага, полученный из культуры объемом 2 л.