НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

II. Добавление отростков к головкам фага P22

Многие частицы фага, полученные после индукции клеток, лизогенных по фагу P22, оказываются без отростков. Отростки можно присоединить к таким частицам, пользуясь приведенной ниже методикой, в основе которой лежит метод Израиля и др. (Israel et al., 1967).

Эта методика включает получение лизата мутанта фага, дефектного по головке. Фаг этот песет также мутацию 13-, которая предотвращает лизис и способствует накоплению больших количеств отростков. Для получения хвостовых отростков фага Р22 используется штамм P22-503 (с 1-7 12amN114 73amH101), а в качестве его хозяев - штаммы Salmonella TR248 (cysA1349 am hisC527am) и TR251 (cisA 1349am hisC527am supD [sul+]).

А. Получение хвостовых отростков

  1. Вырастите препарат фага P22-503 на клетке-хозяине TR251 (методики 2 и 3).
  2. Проверьте концентрацию ревертантов, высевая полученный препарат фага на штамм TR251 (пермиссивный для амбер-мутантов) и на штамм TR248 (непермиссивный для амбер-мутантов).
  3. Вырастите 2 л культуры TR248 в бульоне LB при 37°С до плотности ~2·108 клетка/мл.
  4. Заразите фагом P22-503 с множественностью заражения 5 фагов на клетку.
  5. После заражения инкубируйте в течение 90 мин при 37°С со встряхиванием.
  6. Осадите зараженные клетки цетрифугированием (6000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируйте их в физиологическом растворе (1/100 исходного объема).
  7. Лизируйте клетки, добавив хлороформ и интенсивно встряхивая.
  8. Обработайте ДНКазой (10 мкг/мл) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  9. Отцентрифугируйте препарат в течение 15 мин при 5000 об/мин, чтобы удалить обломки клеток.
  10. Чтобы удалить все целые фаговые частицы, центрифугируйте в течение 2 ч при 17000 об/мин. Проведите повторное центрифугирование. Каждый раз собирайте надосадочную жидкость и отбрасывайте осадок.
  11. Проверьте надосадочную жидкость на содержание в ней интактного фага, высеяв ее на газон TR251. Фага должно содержаться менее чем 104 БОЕ/мл.

Б. Присоединение хвостовых отростков к головкам

Смешайте суспензии отростков и головок фага и инкубируйте в течение 2 ч при 30°С. Проводя высев, следите за нарастанием титра фага. Чтобы насытить ~5·1012 головок, полученных при индукции культуры NK337 объемом 1,5 л, используйте препарат отростков фага, полученный из культуры объемом 2 л.

предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru