Обсуждение

I. Эта методика получения дефектного трансдуцирующего фага описана Клекнером и др. (Kleckner et al., 1975). Фаг получают при индукции лизогенного штамма NK337 под действием высокой температуры. Генотип штамма NK337: hisC527 leu-414 supE (P22 c2ts29 12amN11 13amH101 int-STn10).

Имеющийся в этом штамме супрессор супрессирует амбер-мутации в генах 12 и 13 фага. Индукция при 40°С происходит из-за мутации c2ts29. Мутация в гене int фага обусловливает высокую частоту неправильного вырезания профага, и в результате фаги получаются дефектными, но включают элемент Tn10.

II. Методика транспозиции при трансдукции основана на том, что клетки заражают фагом с Tn10 таким образом, что интеграция транспозона в результате лизогенизации или в результате обычной рекомбинации оказывается невозможной. Фаг, несущий Tn10, является c2ts, и поэтому при высокой температуре не может установиться состояние репрессии. Этот фаг также мутантен по генам 12 и 13, так что в реципиентных su^--клетках происходит лишь очень незначительная репликация такого полного фага. Наконец, мутация int^- приводит к тому, что большинство фагов в препарате оказывается дефектными из-за неправильного вырезания (см. выше разделы о выращивании дефектного фага Р22 и соединении его с отростками).

Мутация int^- у реципиента препятствует также интеграции генома любого фага, избежавшего действия указанных выше рестрикций. Предотвращается также и гомологичная рекомбинация, так как транспозон Tn10 встроен в геном фага, а используемый реципиент не содержит фаговых последовательностей.

Трансдукционные чашки содержат ЭГТА, который хелатирует ионы Ca²⁺ и тем самым препятствует адсорбции фага. В результате предотвращается размножение на трансдукционной чашке жизнеспособного фага. Использовать чашки Green не обязательно, но они недороги и позволяют выявлять те колонии, в которых размножается фаг (такие колонии оказываются темно-зелеными). Незаряженные колонии и колонии стабильных лизогенов оказываются бледно-окрашенными.

Литература

Israel J. V., Anderson T. F., Levine M., 1967. In vitro morphogenesis of phage P22 from heads and base-parts, Proc. Natl. Acad. Sci., 57, 284.

Kleckner N., Chen R., Tye B.-K., Botstein D., 1975. Mutagenesis by insertion of a drug-resistance element carrying an inverted repetition, j. Mol. Biol., 97, 561.