Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

Методика 10. Тесты на рекомбинацию и комплементацию фага in vivo

I. Стандартное скрещивание (для определения частоты рекомбинации или для создания рекомбинанта)

  1. Вырастите ночную культуру бактериального штамма, пермиссивного для обоих фагов, которые вы будете скрещивать. Определите точный титр каждого из этих фагов (методика 1).
  2. Разведите культуру 1/1000 в среде TYM (если скрещиваете фаги λ) или в среде LB (если скрещиваете фаги P22) и подрастите культуру до плотности не выше, чем 2·108 клетка/мл (по Клетту, это 40; можно пользоваться также камерой Петрова - Хауссера).
  3. Осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в холодной среде для разведения фага λ (если скрещиваете фаги λ) или в забуференном физиологическом растворе (если скрещиваете фаги P22). Ресуспендируйте таким образом, чтобы получилась плотность 4·108 клетка/мл.
  4. Каждый из родительских фагов разведите до титра 4·109 фаг/мл. Смешайте их вместе в соотношении 1:1.
  5. 0,2 мл смеси фагов добавьте к 0,2 мл суспензии клеток и проведите адсорбцию в течение 15 мин при 37°С.
  6. Разведите в 104 раз в бульоне LB (но не TYM), предварительно прогретом до 37°С, и инкубируйте в течение 90 мин. После этого добавьте 2 капли хлороформа.
  7. Оттитруйте при условиях, которые пермиссивны для обоих родительских фагов (чтобы определить полный титр потомства), и при условиях, непермиссивных ни для одного из фагов-родителей (чтобы определить титр рекомбинатов). Частота рекомбинации = (2×титр в непермиссивных условиях): (полный титр потомства).
предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"