Методика 10. Тесты на рекомбинацию и комплементацию фага in vivo

I. Стандартное скрещивание (для определения частоты рекомбинации или для создания рекомбинанта)

1. Вырастите ночную культуру бактериального штамма, пермиссивного для обоих фагов, которые вы будете скрещивать. Определите точный титр каждого из этих фагов (методика 1).
2. Разведите культуру ¹/₁₀₀₀ в среде TYM (если скрещиваете фаги λ) или в среде LB (если скрещиваете фаги P22) и подрастите культуру до плотности не выше, чем 2·10⁸ клетка/мл (по Клетту, это 40; можно пользоваться также камерой Петрова - Хауссера).
3. Осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в холодной среде для разведения фага λ (если скрещиваете фаги λ) или в забуференном физиологическом растворе (если скрещиваете фаги P22). Ресуспендируйте таким образом, чтобы получилась плотность 4·10⁸ клетка/мл.
4. Каждый из родительских фагов разведите до титра 4·10⁹ фаг/мл. Смешайте их вместе в соотношении 1:1.
5. 0,2 мл смеси фагов добавьте к 0,2 мл суспензии клеток и проведите адсорбцию в течение 15 мин при 37°С.
6. Разведите в 10⁴ раз в бульоне LB (но не TYM), предварительно прогретом до 37°С, и инкубируйте в течение 90 мин. После этого добавьте 2 капли хлороформа.
7. Оттитруйте при условиях, которые пермиссивны для обоих родительских фагов (чтобы определить полный титр потомства), и при условиях, непермиссивных ни для одного из фагов-родителей (чтобы определить титр рекомбинатов). Частота рекомбинации = (2×титр в непермиссивных условиях): (полный титр потомства).