Обсуждение

Для поддержания структурной целостности головки фага λ необходимы ионы магния. Удаление их хелатирующими соединениями, например ЭДТА или пирофосфатом, приводит к разрушению тех головок фага λ, в которых содержание ДНК больше, чем 96% от содержания ДНК в фаге дикого типа. Поэтому, действуя хелатирующими соединениями на препараты фага λ, можно отобрать из них естественно возникающие там делении. Обычно для этого необходимо провести несколько циклов отбора, так как в любой популяции присутствуют природные варианты фага λ (λ^*), устойчивые к хелатирующим соединениям не потому, что они содержат меньше ДНК, а по другим причинам (возможно, потому, что у них повышено содержание белка). Обычно при этих последующих циклах проводят высев на чашки с хелатирующим соединением. Более подробно об этой методике см. в работе Паркинсона и Хаски (Parkinson and Huskey, 1971). Необходимо начать работу с фага, геном которого достаточно велик, чтобы он был чувствителен к таким хелатирующим соединениям, как ЭДТА. Проще всего определить это эмпирическим путем с помощью чашек с ЭДТА. Чтобы проверить фаг, нанесите его штрихом на газон E. coli на чашке с триптиказой и ЭДТА (1 мМ). (В зависимости от партии триптиказы или агара необходимая концентрация ЭДТА может варьировать.) Используйте верхний агар также с триптиказой и ЭДТА. Параллельно с такой проверкой фага на среде с ЭДТА нанесите фаг штрихом и на обычные чашки для фага λ с верхним агаром для этого фага. На каждую чашку нанесите и штрихи контрольных фагов λ⁺ (дикий тип), и λ cI857 b515 b519 nin5 intam29. Сравните размеры бляшек, появившихся после инкубации в течение ночи при 42°С. Чувствительный к ЭДТА фаг образует крошечные бляшки (или вообще не образует их). Важно проводить проверку именно путем рассева до отдельных бляшек, так как на основании спот-теста надежных выводов сделать нельзя.

Литература

Parkinson J. S., Huskey R. J., 1971. Deletion mutants of bacteriophage lambda. Isolation and initial characterization, J. Mol. Biol., 56, 369.