Методика 9. Отбор делеционных мутантов фага λ

1. Получите на чашках препарат чувствительного к ЭДТА фага (см. обсуждение). Фаг элюируйте из агара раствором для разведения фага λ без магния. Можно также развести обычный препарат фага в 5 раз средой для разведения фага λ без магния.
2. Разведите такой препарат фага, содержащий мало магния, в 10 мМ ЭДТА (рН 7). Если титр фага в препарате оказался слишком низким, чтобы его можно было разводить (ниже, чем 1010 частица/мл), то можно просто добавить в него ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ, учитывая при этом, конечно, содержание Mg²⁺ в препарате.
3. Инкубируйте в течение 30 мин при 48°С. Титр фага должен упасть в 10⁴-10⁵ раз. Если отбираются более протяженные делении или если отбираются делении среди малочувствительных препаратов фага, то инкубировать можно и при более высокой температуре.
4. Из обработанного препарата (содержащего не менее 105 частица/мл) отберите 0,1 мл и используйте этот объем для получения нового препарата фага на чашке. В методике 2 описано, как это сделать. Пользуйтесь чашками для фага λ.
5. Полученный новый препарат фага опять прогрейте с ЭДТА, как это делалось на этапах 1-3. Титр должен упасть не более чем в 10³ раз.
6. Суспензию фага, прошедшего повторную обработку, высейте для получения отдельных бляшек. Их можно переколоть и каждую по отдельности проверить на наличие мутаций (как описано в методике 8). Можно также высеять суспензию на индикаторные чашки, которые позволяют прямо идентифицировать мутантов (например, на чашки Red, как это описано в методике 7).