Обсуждение

Гидроксиламин является мощным мутагеном, который можно использовать для обработки in vitro ДНК или ДНК-содержащих вирусов. Достоинство этого соединения состоит в том, что известны его механизм действия и специфичность. Он вызывает исключительно транзиции G→A. При правильном его применении получается очень высокое отношение мутаций к деталям. Поэтому им пользуются в тех случаях, когда возникает необходимость в сильном мутагенезе (например, при локализованном мутагенезе). Кроме того, следует иметь в виду, что тяжелый химический мутагенез часто приводит к образованию множественных мутаций. При работе с умеренными фагами степень мутагенеза удобно определять, выявляя среди выживших фагов мутантов, дающих прозрачные бляшки; имеет смысл следить за количеством мутантов, образующих прозрачные бляшки, даже в экспериментах по локализованному мутагенезу, так как просто по выживаемости степень мутагенеза надежно установить нельзя.

I. А. В случае фага P22 MgCl₂ можно заменить на стерильную воду. Фаги λ (особенно те, у которых геном больше обычного) чувствительны к ЭДТА, и потому нужно добавлять MgCl₂. На холоду небольшое количество ЭДТА в среде LBSE не оказывает сильного влияния на выживаемость; при разведении в два раза в среде для разведения фага λ активность ионов Mg²⁺ восстанавливается.

Б. В тех случаях, когда мутагеном обрабатывают c⁺-фаг, полезно определить частоту мутаций, приводящих к появлению прозрачных бляшек. Прозрачные бляшки выявляются даже на таких чашках, которые довольно плотно заполнены бляшками. При максимально возможном мутагенезе прозрачными оказывается около 5% бляшек.

В. Обычная схема выделения амбер-мутаций в генах фага включает высев мутагенизированного фага на чашку с газоном su⁺ при 30°С и перекалывание образовавшихся бляшек на три чашки: с газоном su^- (которую инкубируют при 40°С), с газоном su⁺ (которую инкубируют при 40°С) и еще на одну чашку с газоном su⁺ (которую инкубируют при 30°С). Следуя такой схеме, можно выделить и амбер-мутантов, и температурочувствительных мутантов.

II. А. Важно провести очистку новых мутантов как можно раньше, чтобы освободить их от фаговых частиц. В случае фага P22 добавление ЭГТА в среду, используемую для идентификации мутантов, повысит вероятность выделения чувствительных к фагу нелизогенных мутантов.

Б. См. выше I-Б.

Литература

Hall D. H., Tessman I., 1966. T4 mutants unable to induce deoxycytidylate deaminase activity, Virology, 29, 339.

Parkinson J. S., 1968. Genetics of the left arm of the chromosome of bacteriophage iambda, Genetics, 59, 311.