II. Локализованный мутагенез (по котрансдукции)

1. Смешайте 1 мл буфера фосфат-ЭДТА, 1,5 мл стерильной воды, 2 мл гидроксиламина и 0,5 мл фага P22 (2·10¹¹-2·10¹² БОЕ/мл), выращенного на донорном штамме с каким-нибудь маркером, по которому можно проводить отбор и который сцеплен с той областью, в которой намереваетесь специфически получать мутации (Hong and Ames, 1971).
2. Инкубируйте при 37°С в течение 20-50 ч.
3. Периодически (через каждые 6-8 ч) отбирайте пробы, разводя их в холодной среде LBSE.
4. Сразу же титруйте эти пробы, чтобы определить выживаемость и частоту мутаций, приводящих к прозрачным бляшкам (см. обсуждение).
5. Примерно через 30-50 ч (или когда выживаемость составит около 0,1-1%) отцентрифугируйте смесь в роторе Sorvall в течение 2 ч при 1700 об/мин, чтобы осадить фаг. Ресуспендируйте осадок в 1 мл среды LBSE, просто залив его на ночь (периодически встряхивая). (Не разбивайте осадок с помощью пипетки.)
6. Для трансдукции высейте около 0,1 мл мутагенизированного фага и 10⁸ бактерий на чашку. Чашки должны быть со средой, которая является селективной для используемого селектируемого сцепленного маркера (например, Tet^R). Когда появятся колонии, их нужно перепечатать на чашки-реплики, чтобы выявить мутантов, несущих мутации, сцепленные с селектируемым маркером (например, Tn10).

Литература

Hong J.S., Ames B. N., 1971. Localized mutagenesis of any specific small region of the bacterial chromosome, Proc. Natl Acad. Sci., 68, 3158.