Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

II. Локализованный мутагенез (по котрансдукции)

  1. Смешайте 1 мл буфера фосфат-ЭДТА, 1,5 мл стерильной воды, 2 мл гидроксиламина и 0,5 мл фага P22 (2·1011-2·1012 БОЕ/мл), выращенного на донорном штамме с каким-нибудь маркером, по которому можно проводить отбор и который сцеплен с той областью, в которой намереваетесь специфически получать мутации (Hong and Ames, 1971).
  2. Инкубируйте при 37°С в течение 20-50 ч.
  3. Периодически (через каждые 6-8 ч) отбирайте пробы, разводя их в холодной среде LBSE.
  4. Сразу же титруйте эти пробы, чтобы определить выживаемость и частоту мутаций, приводящих к прозрачным бляшкам (см. обсуждение).
  5. Примерно через 30-50 ч (или когда выживаемость составит около 0,1-1%) отцентрифугируйте смесь в роторе Sorvall в течение 2 ч при 1700 об/мин, чтобы осадить фаг. Ресуспендируйте осадок в 1 мл среды LBSE, просто залив его на ночь (периодически встряхивая). (Не разбивайте осадок с помощью пипетки.)
  6. Для трансдукции высейте около 0,1 мл мутагенизированного фага и 108 бактерий на чашку. Чашки должны быть со средой, которая является селективной для используемого селектируемого сцепленного маркера (например, TetR). Когда появятся колонии, их нужно перепечатать на чашки-реплики, чтобы выявить мутантов, несущих мутации, сцепленные с селектируемым маркером (например, Tn10).

Литература

Hong J.S., Ames B. N., 1971. Localized mutagenesis of any specific small region of the bacterial chromosome, Proc. Natl Acad. Sci., 68, 3158.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"