Методика 8. Индукция мутаций гидроксиламином

I. Выделение мутаций в фаге или клонированном гене (например, в гене β-лактамазы)

1. Смешайте 0,4 мл буфера фосфат-ЭДТА (0,5 М KPO₄, рН 6,0, и 5 мМ ЭДТА), 0,5 мл стерильной воды, 0,8 мл раствора гидроксиламина (свежеприготовленный 1 М NH₂OH при рН 6; 0,56мл/4М NaOH добавлено к 0,35 г NH₂OH и доведено стерильной водой до 5 мл), 0,1 мл стерильного 0,2 М MgSO₄ (для фага λ) и 0,2 мл препарата фага (10⁹-10¹¹ БОЕ/мл).
2. Приготовьте контрольную пробу (вместо гидроксиламина добавлена стерильная вода).
3. Инкубируйте эти смеси при 37°С в течение 12-48 ч.
4. Периодически (примерно через каждые 6-8 ч) отбирайте пробы, разводите их ¹/₁₀₀ холодной средой LBSE (среда LB, содержащая 1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА). Через 1 ч разводите их в 2 раза средой для разведения фага λ и держите на холоду.
5. Каждую пробу оттитруйте на пермиссивных клетках-хозяевах. Через 24 ч инкубации с гидроксиламином выживаемость упадет до нескольких процентов, а в контрольных пробах она должна составлять 50-100%. Высевайте на чашки несколько таких разведений, чтобы образовалось 1000-3000 бляшек. Эти чашки можно будет использовать для определения частоты прозрачных бляшек. Разведения стабильнее, чем пробы в LBSE, так что оставьте разведения на холоду, чтобы потом можно было высеять их на много чашек.
6. Выделите мутантов фага. Для этого высейте на чашки с пермиссивным хозяином подходящие разведения (чтобы получилось ~100 бляшек на чашке). Уколом стерильными зубочистками отберите бляшки со свежих чашек (<18 ч) и переколите их на чашки с непермиссивным и пермиссивным хозяином (т. е. на свежеприготовленные чашки с соответствующими бактериями, высеянными в верхнем агаре). Часто оказывается желательным стерилизовать газон перед тем, как уколом отбирать чашки. Для этого чашку держат в течение примерно 10 мин в перевернутом виде над ванночкой с хлороформом.