НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

Методика 8. Индукция мутаций гидроксиламином

I. Выделение мутаций в фаге или клонированном гене (например, в гене β-лактамазы)

  1. Смешайте 0,4 мл буфера фосфат-ЭДТА (0,5 М KPO4, рН 6,0, и 5 мМ ЭДТА), 0,5 мл стерильной воды, 0,8 мл раствора гидроксиламина (свежеприготовленный 1 М NH2OH при рН 6; 0,56мл/4М NaOH добавлено к 0,35 г NH2OH и доведено стерильной водой до 5 мл), 0,1 мл стерильного 0,2 М MgSO4 (для фага λ) и 0,2 мл препарата фага (109-1011 БОЕ/мл).
  2. Приготовьте контрольную пробу (вместо гидроксиламина добавлена стерильная вода).
  3. Инкубируйте эти смеси при 37°С в течение 12-48 ч.
  4. Периодически (примерно через каждые 6-8 ч) отбирайте пробы, разводите их 1/100 холодной средой LBSE (среда LB, содержащая 1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА). Через 1 ч разводите их в 2 раза средой для разведения фага λ и держите на холоду.
  5. Каждую пробу оттитруйте на пермиссивных клетках-хозяевах. Через 24 ч инкубации с гидроксиламином выживаемость упадет до нескольких процентов, а в контрольных пробах она должна составлять 50-100%. Высевайте на чашки несколько таких разведений, чтобы образовалось 1000-3000 бляшек. Эти чашки можно будет использовать для определения частоты прозрачных бляшек. Разведения стабильнее, чем пробы в LBSE, так что оставьте разведения на холоду, чтобы потом можно было высеять их на много чашек.
  6. Выделите мутантов фага. Для этого высейте на чашки с пермиссивным хозяином подходящие разведения (чтобы получилось ~100 бляшек на чашке). Уколом стерильными зубочистками отберите бляшки со свежих чашек (<18 ч) и переколите их на чашки с непермиссивным и пермиссивным хозяином (т. е. на свежеприготовленные чашки с соответствующими бактериями, высеянными в верхнем агаре). Часто оказывается желательным стерилизовать газон перед тем, как уколом отбирать чашки. Для этого чашку держат в течение примерно 10 мин в перевернутом виде над ванночкой с хлороформом.
предыдущая главасодержаниеследующая глава






Генетики нашли в ДНК мужчин следы древней «войны кланов»

Европейцы и азиаты посветлели независимо друг от друга

Современные высшие растения возникли в результате сдвига экспрессии генов

Генетики нашли «семью», состоящую из 13 миллионов человек

Прочитали рекордный по длине геном мексиканской амбистомы - 32 миллиарда пар нуклеотидных оснований

ДНК человека, умершего в 1827 году, восстановили без его останков

Генетики изучили жителей Новой Гвинеи

Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru