III. Спот-тест на комплементацию мутантов фага (λ или P22)

Можно быстро проверить попарно мутантов фага на комплементацию, проведя спот-тест на чашках, засеянных непермиссивной клеткой-хозяином. Удобно проводить адсорбцию одного из фагов, тестируемых на комплементацию, на непермиссивных клетках в верхнем агаре, дать агару застыть на чашке, а затем сверху нанести капли другого фага (фагов). Достоверность спот-теста сильно возрастает, если по очереди адсорбировать на клетках каждый из исследуемых мутантов, так что для каждой пары мутантов проводят реципрокные пары тестов. Часто бывает полезно тестировать несколько разведений каждого фага.

1. Вырастите ночную культуру непермиссивной клетки-хозяина в бульоне LB.
2. Разведите клетки ¹/₅₀ в среде TYM (в случае фага λ) или LB (в случае фага P22) и подрастите культуру до плотности не выше 2·10⁸ клетка/мл.
3. К 0,2 мл клеток добавьте 10⁷-10⁸ частиц того фага, который будете тестировать. Добавьте 2,5 мл расплавленного верхнего агара для фага λ и высейте на чашку для фага λ. Предварительная адсорбция необязательна. В качестве контроля приготовьте также чашку с бактериальным газоном без фага.
4. После того, как агар затвердеет (примерно через 10 мин), нанесите стерильным капилляром капли объемом около 20-50 мкл различных препаратов фага, которые должны тестироваться. Лучшие результаты получаются при использовании ряда разведений каждого препарата. Разведения 10^-2, 10^-3 и 10^-4 препаратов фага с титром около 10¹⁰ фаг/мл перекрывают нужный диапазон. На каждой чашке используйте в качестве контролей фаг дикого типа. Другим контролем на каждой чашке служит фаг, адсорбированный на клетках газона.
5. Инкубируйте в течение ночи при 37°С (или при более высокой температуре, если в тесте участвует температурочувствительный мутант).

Комплементация произошла, если даже при высоких разведениях есть пятно лизиса, кроме, конечно, того пятна, которое имеется и в соответствующем контроле. В высокой концентрации (низком разведении) фаг иногда может убивать и такие клетки, на которых он не может развиваться. От такого типа неразберихи могут уберечь лишь контроли. Всегда полезно использовать несколько разведений.

Результаты спот-теста являются лишь ориентиром. В большинстве случаев, чтобы подтвердить наличие комплементации, на самом деле необходимо следить за размножением фага после совместного заражения клеток в жидкой культуре.