Обсуждение

I. 1. Для скрещивания два фага с разными генотипами адсорбируют на одной и той же пермиссивной бактерии-хозяине. При этом можно использовать любые клетки, лишь бы у них не была повреждена система рекомбинации. Штамм C600 содержит supE, а штамм BNN45 содержит и супрессор supE, и супрессор supF и, кроме того, является hsdR^- hsdM⁺. Поэтому в последней клетке-хозяине можно проводить скрещивание амбер-мутантов немодифицированного фага. 2. По-видимому, рекомбинация выше в экспоненциально растущих клетках. Усилить рекомбинацию можно также, облучив клетки низкими дозами ультрафиолета до того, как будет проведено скрещивание фагов.

3. Концентрирование клеток обеспечивает хорошую адсорбцию фага.

4. (Этапы 4 и 5); цель состоит либо в определении частоты рекомбинации, либо в создании рекомбинантного штамма. И в том и в другом случае используется одна и та же методика. В обоих случаях очень важно, чтобы условия были как можно более пермиссивными. Искажения при скрещиваниях, обусловленные селекцией, могут легко привести к невозможности интерпретировать полученные результаты или к слишком низкой частоте появления искомых рекомбинатов. Очень важным фактором является множественность заражения. Она должна быть достаточно высокой, чтобы каждую клетку заразило примерно одинаковое число того и другого фага, но не настолько высокой, чтобы препятствовать размножению фага. Обычно используют множественность заражения от пяти до семи фагов каждого из родительских типов на клетку. Рекомендуется определять титры фагов за день-два до проведения скрещивания.

5. (Этап 6): клетки разводят для того, чтобы обеспечить хорошую аэрацию при последующем росте и чтобы предотвратить реадсорбцию после лизиса клеток. Использование на этой стадии бульона LB (который не содержит мальтозы) приводит к дополнительному подавлению реадсорбции потомства фага λ после лизиса.

6. (Этап 7); критериями успешного скрещивания служат выход фага (должен быть выше 20), равная передача родительских маркеров и хорошая адсорбция внесенного фага. Обычно, чтобы получить частоты рекомбинации при скрещиваниях, определяют все эти параметры. Если частоты рекомбинации низки, то важно знать частоту ожидаемых ревертантов. Таким удобным контролем служит заражение каждым из скрещиваемых фагов по отдельности.

II. 1. Тест на комплементацию в жидкой среде проводят почти так же, как и скрещивания, за исключением того, что в качестве клеток-хозяев при этом выступает непермиссивный штамм бактерий. Здесь также важно заражать клетки равным количеством фагов (множественность заражения 5-10), определять количество неадсорбированного фага и число клеток в момент инфицирования, а также и выход фага, что в данном случае и составляет цель эксперимента. Чтобы понизить фон неадсорбированного фага, часто пользуются сывороткой против него. При комплементации в жидкой среде очень важно ставить в качестве контроля заражение каждым из родительских фагов по отдельности, а также определять частоту рекомбинации при непермиссивных условиях, так как реверсии и рекомбинация могут привести к неожиданно высоким выходам.

Для 'мыслителей', которые не любят работать в лаборатории, мысленные эксперименты (gedanken experiments) - это выход из положения. Некоторые мысленные эксперименты приносят реальную пользу, а о некоторых лучше бы забыть

При комплементации важно, чтобы адсорбция и заражение проходили при строго непермиссивных условиях. Например, при тесте на комплементацию температурочувствительного мутанта и амбер-мутанта используют хозяина su^- и высокую температуру. Поэтому нужно внимательно следить за температурой, при которой происходят адсорбция и рост. В качестве контроля необходимо проводить заражение фагом дикого типа и заражение по отдельности каждым использованным мутантом в тех же самых условиях.

2. Титровать следует на хозяине, пермиссивном для обоих родительских фагов (например, на клетках su⁺ при 25°С в случае комплементации между температурочувствительным мутантом и ашбер-мутантом фага). Выводы основаны на сравнении выхода при совместном заражении с выходом при заражении каждым мутантом по отдельности и с выходом при заражении фагом дикого типа.