Методика 11. Выделение ДНК из фага λ

I. Формамидный метод

А.
1. Смешайте 1 объем фага в растворе CsCl с плотностью, равной плавучей плотности фага, 10 мМ MgSO₄, 10 мМ. трис (рН 8), и 0,1 мМ Na₂-ЭДТА с ¹/₁₀ объема 2 М трис и 0,2 М Na₂-ЭДТА (рН 8,5) в полипропиленовой пробирке от микрофуги.
2. Добавьте 1 объем формамида и оставьте при комнатной температуре на время от 30 мин до нескольких часов.
3. Добавьте 1 объем H₂O.
4. Добавьте 6 объемов этанола при комнатной температуре.
5. Осадите ДНК, проведя центрифугирование в микрофуге в течение 2 с.
6. Слейте надосадочную жидкость. Сполосните осадок 70%-ным этанолом.
7. Слейте раствор, которым промывали осадок. Сухой осадок растворите в 10 мМ трис (рН 7,5) и 1 мМ Na₂-ЭДТА.
8. Для длительного хранения повысьте концентрацию соли.

Б.
1. Смешайте фаг в растворе CsCl с плотностью, равной плавучей плотности фага, 10 мМ MgSO₄, 10 мМ трис (рН 8), и 0,1 мМ Na₂-ЭДТА с ¹/₁₀ объема 0,2 М Na₂-ЭДТА.
2. Диализуйте против 50% раствора формамида, 0,2 М трис (рН 8,5) и 0,02 М Na₂-ЭДТА при комнатной температуре в течение 12-24 ч.
3. Диализуйте против буфера для хранения ДНК (0,1 М NaCl, 0,05 М трис (рН 8,5) и 0,01 М Na₂-ЭДТА). Если будете расщеплять препарат ДНК эндонуклеазой EcoRI, то диализуйте против 0,1 М NaCl, 0,05 М трис (рН 7,4) и 0,1 мМ Na₂-ЭДТА.
4. Необходимо четыре раза сменять буфер в объеме, в 200 раз превышающем объем диализуемого раствора.

Литература

Thomas M., Davis R. W., 1974. Studies on the cleavage of bacteriophage lambda DNA with ?coRI restriction endonuclease, J. Mol. Biol, 91, 315.

St. John T. (личное сообщение).