Обсуждение

Обычно ДНК фага λ выделяют из препарата фага фенольной экстракцией, проводя затем экстракцию эфиром, чтобы удалить растворенный фенол. Нами обнаружено, что при использовании формамидного метода полученная ДНК содержит меньше одноцепочечных разрывов и обладает большей инфекционностью. Возможно, что при этом не удаляются фаговые белки, остающиеся в виде "теней" бактериофага. Мы не наблюдали, однако, чтобы при использовании таких препаратов ДНК каким-либо образом иигибировалась работа большинства ферментов. По-видимому, при обработке формамидом ДНК фага выпрыскивается через хвостовой отросток.

А.

1. Ns₂-ЭДТА добавляют для того, чтобы хелатировать ионы Mg²⁺.
2. Выпрыскивание ДНК происходит, очевидно, очень быстро. Однако длительный контакт с формамидом, по-видимому, не оказывает на ДНК повреждающего действия.
3. Воду добавляют для того, чтобы CsCl не выпал в осадок после добавления этанола.
4. (Этапы 4 и 5); ДНК быстро образует преципитат, и обычно для этого не требуется охлаждать раствор. Если центрифугирование не будет таким кратковременным, то ДНК трудно будет ресуспендировать.
5. (Этап 6); осадок споласкивают, чтобы удалить остатки CsCl и формамида.
6. (Этапы 7 и 8); ДНК быстрее всего растворяется при очень низкой концентрации соли. Однако при длительном хранении (в течение месяцев) ДНК меньше деградирует при более высоких концентрациях соли и Na₂-ЭДТА.

Б.

Эта методика аналогична приведенной выше, но в данном случае добавление и удаление формамида проводят с помощью диализа. При этом не требуется осаждения этанолом. В формамиде могут содержаться примеси, которые не удаляются при осаждении спиртом. Очевидно, все то, что в процессе диализа может поступать внутрь мешка, может при последующем диализе удаляться оттуда.

Эта методика, по-видимому, лучше всего подходит для получения больших количеств ДНК фага λ, так как большой осадок ДНК после осаждения этанолом может растворяться плохо.