Обсуждение

I. По-видимому, на эффективность трансфекции влияет история культуры. Поэтому всегда выращивайте сначала ночную культуру, а затем разводите ее в 100 раз и подращивайте. Не следует выращивать культуру до плотности, большей чем A₆₀₀=0,7. Если культура переросла, то начните выращивать новую культуру, разведенную в 100 раз. Важное значение имеет хорошая аэрация, и поэтому выращивайте культуру в большой колбе. При использовании некоторых штаммов бактерий добавление тимидина повышает эффективность трансформации в два - четыре раза.

II. Для получения высокой эффективности трансформации важно строго выдерживать культуру на холоду (при 0°С). Клетки нельзя нагревать даже на короткое время.

III. При использовании более 100 нг ДНК на трансфекцию общее число бляшек, образующихся на чашке, может снизиться. Тонкостенной стеклянной (не пластиковой) пробиркой пользуются для того, чтобы получился более быстрый температурный шок. В случае фага λ, но не в случае плазмид очень важно, чтобы нагрев до 45°С происходил быстро. Ожидаемая эффективность составляет 2·10³ бляшек на 1 нг, но это - максимальное значение.

IV. Если используются замороженные клетки, то эффективность трансфекции ДНК фага λ обычно снижается в 2-10 раз. С успехом могут использоваться клетки, хранившиеся замороженными в течение 9 мес.

Клетки

SF8 (E. coli) hsdR^- hsdM^- recB recC lop-11 (суперпродуцент лигазы) supE44 (su2⁺) gal-96 Sm^R leuB6 thi-l (Bl^-) thr^-

HB101 (E. coli) hsdR^- hsdM^- recA13 supE44 (su2⁺) lacZ4 leuB6 proA2 thi-l (Bl^-) Sm^R

BNN45 (E. coli) hsdR^- hsdM⁺ rec⁺ supE44 (su2⁺) supF (su3⁺) Bl^- met^-

Литература

Mandel M., Higa A., 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol., 53, 159.