НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

Методика 17. Субклонирование фрагментов ДНК в векторах-плазмидах E. coli

  1. В пробирке на 1,5 мл от микрофуги проведите полное расщепление примерно 250 нг плазмидной ДНК (например, ДНК pBR322) соответствующей эндонуклеазой (эндонуклеазами).
  2. Добавьте 0,1 мкл или менее раствора щелочной фосфатазы из кишечника теленка с концентрацией 1 мг/мл.
  3. Инкубируйте в течение 15 мин при 37°С.
  4. Добавьте равный объем перегнанного фенола, перемешайте в смесителе Vortex. После этого отцентрифугируйте.
  5. Отберите верхнюю водную фазу полипропиленовым наконечником пипетки и перенесите ее в новую пробирку на 1,5 мл от микрофуги.
  6. Добавьте около 0,1 мл насыщенного буфером эфира, перемешайте в смесителе Vortex. Отцентрифугируйте и отбросьте верхнюю фазу (эфир).
  7. Еще два раза повторите экстракцию эфиром.
  8. Продуйте, чтобы удалить эфир.
  9. ДНК, которую нужно клонировать, расщепите соответствующей эндонуклеазой (эндонуклеазами). (Используйте такие количества ДНК, чтобы фрагмента, который хотите встроить, оказалось около 50 нг.)
  10. Фрагмент ДНК, который нужно субклонировать, можно выделить с помощью электрофореза в агарозном геле (необязательно; см. методику 25).
  11. Смешайте эквимолярные количества ДНК вектора и встраиваемой ДНК.
  12. Добавьте АТР до конечной концентрации 1 мМ.
  13. Добавьте ДТТ до конечной концентрации 10 мМ.
  14. Добавьте 0,1 ед. лигазы фага Т4, или 0,1 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл.
  15. Инкубируйте от 30 мин до 3 сут при, 0-10°С.
  16. Проведите трансфекцию клеток RD102 = HB101/λ.
  17. 50 нг обработанной фосфатазой и лигазой ДНК одного лишь вектора обычно приводят к образованию 0-10 колоний.

Литература

St. John T. (личное сообщение).

предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru