Методика 17. Субклонирование фрагментов ДНК в векторах-плазмидах E. coli

1. В пробирке на 1,5 мл от микрофуги проведите полное расщепление примерно 250 нг плазмидной ДНК (например, ДНК pBR322) соответствующей эндонуклеазой (эндонуклеазами).
2. Добавьте 0,1 мкл или менее раствора щелочной фосфатазы из кишечника теленка с концентрацией 1 мг/мл.
3. Инкубируйте в течение 15 мин при 37°С.
4. Добавьте равный объем перегнанного фенола, перемешайте в смесителе Vortex. После этого отцентрифугируйте.
5. Отберите верхнюю водную фазу полипропиленовым наконечником пипетки и перенесите ее в новую пробирку на 1,5 мл от микрофуги.
6. Добавьте около 0,1 мл насыщенного буфером эфира, перемешайте в смесителе Vortex. Отцентрифугируйте и отбросьте верхнюю фазу (эфир).
7. Еще два раза повторите экстракцию эфиром.
8. Продуйте, чтобы удалить эфир.
9. ДНК, которую нужно клонировать, расщепите соответствующей эндонуклеазой (эндонуклеазами). (Используйте такие количества ДНК, чтобы фрагмента, который хотите встроить, оказалось около 50 нг.)
10. Фрагмент ДНК, который нужно субклонировать, можно выделить с помощью электрофореза в агарозном геле (необязательно; см. методику 25).
11. Смешайте эквимолярные количества ДНК вектора и встраиваемой ДНК.
12. Добавьте АТР до конечной концентрации 1 мМ.
13. Добавьте ДТТ до конечной концентрации 10 мМ.
14. Добавьте 0,1 ед. лигазы фага Т4, или 0,1 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл.
15. Инкубируйте от 30 мин до 3 сут при, 0-10°С.
16. Проведите трансфекцию клеток RD102 = HB101/λ.
17. 50 нг обработанной фосфатазой и лигазой ДНК одного лишь вектора обычно приводят к образованию 0-10 колоний.

Литература

St. John T. (личное сообщение).