Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

Методика 18. Трансформация плазмидной ДНК

  1. Разведите выращенную в бульоне LB ночную культуру штамма НВ101, RD102=HB101/λ или BNN45 в 100 раз в свежем бульоне LB (40 мл в колбе на 250 мл) при 37°С. Этого количества культуры достаточно для проведения 20 трансформаций.
  2. Когда плотность культуры достигнет A600=0,6 (через 2-3 ч), осадите клетки центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин и 2°С.
  3. Ресуспендируйте в 20 мл 50 мМ CaCl2 при 0°С и инкубируйте при 0°С в течение 5-60 мин.
  4. Осадите клетки центрифугированием в течение 2 мин при 5000 об/мин и 2°С. Ресуспендируйте в 2 мл 50 мМ CaCl2 при 0°С и инкубируйте при 0°С в течение 5-60 мин.
  5. Добавьте 0,1 мл клеток к ДНК в 0,1 М трис при рН 7,2 (0,09 М трис-HCl, 0,01 М трис-основание) и 0°С. Инкубируйте при 0°С в течение 10 мин.
  6. Тепловая обработка: инкубируйте 2 мин при 37°С. Инкубация в течение 10 мин при комнатной температуре, 2 мин при 37°С и 10 мин при комнатной температуре, 2 мин при 45°С и 10 мин при комнатной температуре или 2 мин при 45°С приводит к одинаковому эффекту (в отличие от того, что наблюдается в случае ДНК фага λ).
  7. Добавьте 1 мл бульона LB и инкубируйте в течение 20 мин при 37°С.
  8. Смешайте с 2,5 мл мягкого агара LB (без антибиотиков) при 47°С и вылейте на чашку LB, содержащую тетрациклин (10 мкг/мл) или ампициллин (50 мкг/мл, свежий раствор). Перед использованием чашки с тетрациклином можно хранить при 10°С в течение нескольких недель. Чашки с ампициллином можно хранить при 10°С перед их использованием в течение нескольких дней.

При использовании клеток HB101 или BNN45 эффективность составляет около 4·102 трансформантов на 1 нг ДНК формы I плазмиды pBR322 (при использовании 5 нг ДНК на чашку).

Как для клеток HB101, так и для клеток BNN45 насыщение при таких условиях достигается при использовании от 50 до 100 нг ДНК на чашку.

Полученные под действием EcoRI линейные молекулы ДНК pBR322 являются, по-видимому, неинфекционными для клеток HB101 (фон в 0,3-0,5% может быть обусловлен присутствием нерасщепленных молекул). Однако они инфекционны для клеток SF8 и дают на них трансформантов в количестве 2-3% от того, что получается при использовании кольцевой замкнутой ДНК.

Литература

Mandel M., Higa A., 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol, 53, 159.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"