Обсуждение

Большинство используемых для клонирования векторов λ не содержит функционально активного сайта прикрепления (att⁺) или функционально активного гена интеграции (int⁺). Поэтому они не могут образовывать стабильных лизогенных бактерий. Можно, однако, использовать фаг-помощник, способный к интеграции. После его интеграции гибридный фаг λ может встроиться уже в результате рекомбинации с гомологичными ему последовательностями. Такие двойные лизогены образуются с частотой около 1%. Излечивание от них происходит довольно легко, но их можно поддерживать с помощью селекции.

1. В качестве помощника предлагается λgt4-lac5. Этот фаг несет мутантный ген репрессора λcI857 и содержит ген β-галактозидазы E. coli (lacZ). При получении препарата фага на чашках используют такие клетки-хозяева, которые не могут расти на минимальных средах. Это делается для того, чтобы исключить возможность загрязнения препаратов фага клетками, способными расти на селективных чашках.
2. Клетки выращивают на минимальной среде, чтобы они к ней адаптировались. Мальтозу добавляют для лучшей адсорбции фага λ.
3. Если перед центрифугированием плотность культуры была значительно ниже, чем 10⁹ клетка/мл, то клетки можно ресуспендировать в меньшем объеме, но так, чтобы получилась плотность около 10¹⁰ клетка/мл.
4. При таком соотношении клеток и фага большинство клеток будет заражено несколькими фагами-помощниками, но небольшая часть клеток будет заражена более чем одним гибридным фагом. Заметьте, что на чашки высевают по многу клеток. Если частота реверсий используемой мутации составляет 10^-7, то из колоний, выросших на минимальных чашках, несколько колоний окажется ревертантами. Эти ревертанты, наверное, содержат интегрированный фаг-помощник и могут содержать какой-то случайный гибрид фага λ. Поэтому важно проводить повторный тест на комплементацию.
5. Инкубирование клеток и фага в высоких концентрациях обеспечивает хорошую адсорбцию.
6. Мягкий агар приготавливается на воде. Его можно расплавить непосредственно перед использованием, а минимальные среды добавить после того, как он охладится до 50°С.
7. Большинство фагов - помощников интеграции несет температурочувствительную мутацию по репрессору cI857. Поэтому температуру никогда нельзя поднимать выше 37°С. Использование мутации cI857 помогает выделять гибрид на этапе 10.
8. Контрольные чашки необходимы, поскольку они позволяют быстро оценить возможность комплементации. Высевая клетки без фага, определяют количество ревертантов в препарате клеток. В разных препаратах может содержаться разное количество ревертантов. Высевая фаг без клеток, определяют содержание в препарате фага клеток, способных расти на минимальных чашках. Высев различных количеств гибридного фага позволяет быстро выявить наличие комплементации, так как число истинных комплементаций должно быть пропорционально количеству гибридного фага. Обычно пул гибридов из Salmonella дает около 10 комплементирующих колоний на чашку.
9. (Этапы 9 и 10); при инкубации суспензии клеток при 42°С происходит индукция лизогенных бактерий (если они несут мутацию cI857). Через 20 мин инкубации индукция становится необратимой.
10. (Этапы 11 и 12); фаг - помощник интеграции несет область lac и на чашках с Xgal образует голубые бляшки. Бесцветные бляшки образуют гибридные фаги, которые могли отвечать за рост клеток.
11. (Этап 13); повторить комплементацию необходимо для того, чтобы подтвердить обнаруженный эффект.

Литература

Struhl K., Cameron J. R., Davis R. W., 1976. Functional genetic expression of eukaryotie DNA in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci., 73, 1471.