II. Отбор из пула гибридов по двойным лизогенам

А. Отбор

1. Приготовьте препарат с высоким титром пула гибридного фага на чашках, а также препарат фага - помощника интеграции (λgt4-lac5). Препараты получайте на клетках, которые не могут расти на селективной минимальной среде (BNN45).
2. Вырастите до поздней экспоненциальной фазы культуру ауксотрофа в 50 мл М9 + 0,2% мальтозы + необходимые пищевые добавки (по 40 мкг/мл каждой из необходимых аминокислот). Определите плотность культуры.
3. Осадите клетки центрифугированием (8000 об/мин, 5 мин). Ресуспендируйте в ¹/₁₀ объема 10 мМ MgSO₄ или в таком объеме, чтобы получилось 10¹⁰ клетка/мл.
4. Смешайте 5·10⁸ клеток с 2·10⁹ частиц фага-помощника и 10⁸ частиц гибридного фага.
5. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
6. Смешайте с 2,5 мл мягкого минимального агара М9 и вылейте на минимальную чашку без питательного вещества, по которому ведется отбор.
7. Выращивайте при 32°С, так как фаг - помощник интеграции несет температурочувствительную мутацию cI857 по респрессору. (Это занимает 1-3 дня.)
8. Контрольные чашки: 1) клетки без фага, 2) фаг без клеток, 3) меньше фага из пула гибридов (10⁷ или 10⁶ фаговых частиц).
9. Уколом отберите каждую выросшую колонию и суспендируйте ее в 0,1-1,0 мл бульона LB.
10. Инкубируйте при 32°С до тех пор, пока культура не помутнеет (до плотности 10⁷-10⁸ клетка/мл). После этого в течение по крайней мере 20 мин инкубируйте при 42°С. Продолжайте инкубировать при 37°С в течение 2 ч. Для полного лизиса добавьте каплю CHCl₃.
11. Штрихом рассейте получившийся лизат до отдельных бляшек на чашке LB с газоном BNN45. В мягкий агар добавьте 40 мкл раствора Xgal с концентрацией 40 мг/мл, чтобы выявить фаг - помощник интеграции λgt4-lac5 (образует голубые бляшки).
12. Из бесцветных бляшек приготовьте на чашках препараты фага с высоким титром.
13. Повторно проверьте комплементацию, начиная с этапа 4.

Б. Материалы

1. Гибридный фаг: любой фаг att^-. Фаг-помощник: любой фаг att⁺int⁺ с функциональной гомологической иммунностью, например фаг λgt4-lac5.
2. Клетка: любой ауксотроф, на котором фаг λ будет образовывать бляшки и который может расти на минимальных средах с пищевыми добавками.
3. Чашки: М9.