НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

II. Отбор из пула гибридов по двойным лизогенам

А. Отбор

  1. Приготовьте препарат с высоким титром пула гибридного фага на чашках, а также препарат фага - помощника интеграции (λgt4-lac5). Препараты получайте на клетках, которые не могут расти на селективной минимальной среде (BNN45).
  2. Вырастите до поздней экспоненциальной фазы культуру ауксотрофа в 50 мл М9 + 0,2% мальтозы + необходимые пищевые добавки (по 40 мкг/мл каждой из необходимых аминокислот). Определите плотность культуры.
  3. Осадите клетки центрифугированием (8000 об/мин, 5 мин). Ресуспендируйте в 1/10 объема 10 мМ MgSO4 или в таком объеме, чтобы получилось 1010 клетка/мл.
  4. Смешайте 5·108 клеток с 2·109 частиц фага-помощника и 108 частиц гибридного фага.
  5. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
  6. Смешайте с 2,5 мл мягкого минимального агара М9 и вылейте на минимальную чашку без питательного вещества, по которому ведется отбор.
  7. Выращивайте при 32°С, так как фаг - помощник интеграции несет температурочувствительную мутацию cI857 по респрессору. (Это занимает 1-3 дня.)
  8. Контрольные чашки: 1) клетки без фага, 2) фаг без клеток, 3) меньше фага из пула гибридов (107 или 106 фаговых частиц).
  9. Уколом отберите каждую выросшую колонию и суспендируйте ее в 0,1-1,0 мл бульона LB.
  10. Инкубируйте при 32°С до тех пор, пока культура не помутнеет (до плотности 107-108 клетка/мл). После этого в течение по крайней мере 20 мин инкубируйте при 42°С. Продолжайте инкубировать при 37°С в течение 2 ч. Для полного лизиса добавьте каплю CHCl3.
  11. Штрихом рассейте получившийся лизат до отдельных бляшек на чашке LB с газоном BNN45. В мягкий агар добавьте 40 мкл раствора Xgal с концентрацией 40 мг/мл, чтобы выявить фаг - помощник интеграции λgt4-lac5 (образует голубые бляшки).
  12. Из бесцветных бляшек приготовьте на чашках препараты фага с высоким титром.
  13. Повторно проверьте комплементацию, начиная с этапа 4.

Б. Материалы

  1. Гибридный фаг: любой фаг att-. Фаг-помощник: любой фаг att+int+ с функциональной гомологической иммунностью, например фаг λgt4-lac5.
  2. Клетка: любой ауксотроф, на котором фаг λ будет образовывать бляшки и который может расти на минимальных средах с пищевыми добавками.
  3. Чашки: М9.
предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru