Обсуждение

1. При высоких концентрациях клеток часто подрастает газон, достаточный для выявления бляшек. Можно добавить на чашку 10 мкг бромистого этидия и выявлять бляшки, освещая чашку длинноволновым УФ-светом. При таких высоких плотностях клеток рост фага все еще зависит от способности; фага комплементировать дефект бактерии-хозяина.
2. На чашку можно высевать до 10⁷ фаговых частиц, и это не препятствует выявлению случаев комплементации, которые возникают с низкой частотой. Эффективность высева равна 1.
3. При необходимости можно, пользуясь стерильными миллипоровыми фильтрами, сделать чашки-реплики. Бляшкам, способным к комплементации, будут соответствовать большие зоны лизиса на газоне E. coli дикого типа после кратковременной инкубации таких чашек при 37°С.
4. Некомплементирующий фаг часто способен вырасти при длительной инкубации и на бактериальных мутантах с неполным блоком. Тем не менее иногда комплементирующие вирусы можно отличить по тому, что образуются бляшки большего размера, или по тому, что они появляются раньше.
5. Остерегайтесь размножения фага, обусловленного присутствием ревертантов.
6. Комплементация может зависеть, а может и не зависеть от ориентации гена. Гибридные фаги λ, содержащие дрожжевую ДНК, комплементируют hisB-мутанты E. coli, если последовательность his-3 дрожжевой ДНК ориентирована таким образом, что может считываться с промотора P_L. Однако клетки RD105 (E. coll trpC9830) могут комплементироваться дрожжевой последовательностью независимо от ее ориентации. Более того, комплементация trpC может происходить и вообще в отсутствие P_L. Различия, наблюдаемые в том, как комплементация зависит от ориентации гена, могут быть обусловлены как силой отбора (для литического развития фага λ необходим лишь очень незначительный синтез триптофана), так и эффективностью экспрессии последовательности эукариотической ДНК.

Литература

Stinchcomb D. (личное сообщение).