II. Окрашивание ДНК в агарозных гелях

Предостережение. Бромистый этидий, продукты его метаболизма и акридиновый оранжевый являются мутагенами. В тесте Эймса 90 мкг бромистого этидия или 80 мкг акридинового оранжевого приводят к такому же результату, как конденсат дыма от одной сигареты или 2 мкг нитрозогуанидина. Поэтому при работе с их растворами надевайте перчатки.

А. Бромистый этидий

Бромистый этидий является интеркалирующим агентом и связывается с двухцепочечной нуклеиновой кислотой. Ультрафиолетовый свет, поглощенный бромистым этидием (300 нм) или ДНК (260 нм), но затем переданный бромистому этидию, испускается в виде флуоресценции при 590 нм. Наилучшее окрашивание получается, если перед проведением электрофореза нуклеиновых кислот в гель и в электрофорезный буфер внести бромистый этидий в концентрации примерно 0,5 мкг/мл. Гель можно окрасить и после окончания электрофореза, вымочив его в буфере с 0,5 мкг/мл бромистого этидия в течение примерно 1 ч. В обоих случаях не обязательно проводить отмывку геля от красителя. Можно прокрасить и одноцепочечную нуклеиновую кислоту. Для этого нужно погрузить гель на 1 ч в 1 мМ MgSO₄ с 5 мкг/мл бромистого этидия, а затем отмыть краситель в 1 мМ MgSO₄ в течение 1 ч.

Имеющийся в продаже бромистый этидий содержит много примесей (на долю самого бромистого этидия приходится лишь около половины веса препарата). Его концентрацию можно опредилить спектрофотометрически.

Б. Акридиновый оранжевый

Акридиновый оранжевый может интеркалировать (встраиваться) в двухцепочечную нуклеиновую кислоту, а может также и связываться с одно- и двухцепочечной нуклеиновой кислотой, взаимодействуя электростатически с ее фосфатными группами. Поглощаемый ультрафиолетовый свет с длиной волны 260 нм может испускаться в виде флуоресценции. При этом двухцепочечная нуклеиновая кислота флуоресцирует при 530 нм (зеленый свет), а одноцепочечная - при 640 нм (красный свет).

Гели окрашивают, выдерживая их в течение 1 ч в растворе 30 мкг/мл акридинового оранжевого в 10 мМ растворе соли. Отмывают в течение 1 ч в 0,1 мМ растворе соли.