III. Фотографирование гелей, содержащих нуклеиновые кислоты

Многие красители, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами, флуоресцируют при облучении УФ-светом. Такие красители, как бромистый этидий, обладают плоской группой, которая может свободно вращаться, если краситель находится в растворе. Если же краситель связан с ДНК, то вращение этой группы оказывается заторможенным. В результате этого флуоресценция таких красителей в связанном с нуклеиновой кислотой состоянии оказывается гораздо выше, чем в растворе с низкой вязкостью. Нуклеиновая кислота может поглощать ультрафиолетовый свет; эта энергия передастся на краситель, а затем высветится в виде флуоресценции.

Максимальная чувствительность при фотографировании получается обычно при облучении светом с длиной волны около 260 нм. Однако при таком облучении быстро нарушается функциональная активность нуклеиновой кислоты (каждая секунда облучения ДНК фага λ снижает ее инфекционность на порядок).

Облучение же в течение нескольких минут светом с длиной волны 365 нм не вызывает заметного снижения инфекционности нативной ДНК фага λ (как с бромистым этидием, так и без него), но приводит к образованию некоторого количества поперечных сшивок.

А. Источник УФ-света

1. Источник с длиной волны 254 нм (TS36, UV Products).
2. Источник с длиной волны 300 нм (TM36, UV Products).
3. Источник с длиной волны 365 нм (TL33, UV Products).

Б. Фильтры

1. Для УФ (контрастный фильтр J-344, UV Products).
2. Для флуоресценции бромистого этидия при 590 нм - желатиновый фильтр 23А, Kodak Wratten.
3. Для флуоресценции акридинового оранжевого при 530 нм и при 640 нм - желатиновый фильтр 12 для флуоресценции в зеленой (от двухцепочечной) и красной (от одноцепочечной нуклеиновой кислоты) областях спектра или фильтр 40 только для зеленого, а фильтр 29 - только для красного света (Kodak Wratten).

В. Фотоаппарат (Polaroid MP-4)

Г. Пленка (Polaroid 667 или 665)

Поскольку большинство фильтров флуоресцируют при УФ-облучении, то контрастный УФ-фильтр всегда помещают между источником УФ-света и цветными фильтрами. При длительном облучении прозрачность для ультрафиолета фильтра в источнике С61 снижается. Время полужизни такого фильтра составляет примерно 20 ч. При длительном облучении, по-видимому, портятся также и контрастный УФ-фильтр, и желатиновые фильтры, так что их следует периодически заменять. При использовании источника С61 с новым фильтром интенсивность света с длиной волны 230-270 нм составляет 2400 мкВ/см², а без фильтра 8500 мкВ/см².