IV. Гели с глиоксалем

А. Приготовление образца

1. Если концентрация нуклеиновой кислоты в препарате достаточно высока, то можно использовать непосредственно такой препарат. В противном случае осадите нуклеиновую кислоту эталоном и ресуспендируйте в H₂O.
2. В пробирке от микрофуги составьте пробу объемом 50 мкл: 25 мкл ДМСО (если необходимо добавлять больший объем препарата, то количество ДМСО можно уменьшить или вообще не добавлять его), 2,5 мкл 0,2 М NaPO₄ (pH 7,0), 7,1 мкл 7М деионизованного глиоксаля, 15,3 мкл препарата.
3. Закройте пробирку крышкой и инкубируйте в течение 60 мин при 50°С.
4. Добавьте сахарозу или глицерол, бромфеноловый синий в качестве красителя и нанесите образец на гель.

Б. Гель

1. В качестве буфера для электрофореза используется 10 мМ NaPO4 (pH 7,0). 
2. Используется гель из 1-1,5%-ной агарозы или 0,5%-ной агарозы и 1,5-2%-ного раствора полиакриламида. 
3. Электрофорез проводится в течение 4-20 ч при 1 В/см. 
4. Необходима рециркуляция буфера в аппарате. 
5. а. Окрашивайте в растворе акридинового оранжевого с концентрацией 30 мкг/мл в течение 30 мин. Отмывайте, погрузив гель на 1 ч в 1 мМ Na3-ЭДТА. 

 или 

 б. Чтобы глиоксилирование не блокировало гибридизации нуклеиновых кислот, проведите обратную реакцию. Для этого выдержите гель в течение 30 мин в 200 мл 50 мМ NaOH. Нейтрализуйте гель и окрасьте нуклеиновую кислоту, поместив гель на 30 мин в 200 мл 0,2 М ацетат натрия (рН 4,0) с бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл. 
   Отмойте гель, поместив его на 30 мин в 0,2 М ацетат натрия (рН 4,0). 
6. Фотографирование. 
   а. Бромистый этидий: освещайте светом с длиной волны 254 нм и фотографируйте, используя УФ-фильтр и оранжевый фильтр. 
   б. Акридиновый оранжевый: освещайте светом с длиной волны 254 нм и фотографируйте, используя УФ-фильтр и желтый фильтр.

Двухцепочечная нуклеиновая кислота - флуоресценция в зеленой области спектра при 530 нм.

Одноцепочечная нуклеиновая кислота - флуоресценция в красной области спектра при 640 нм.

В. Приготовление глиоксаля

1. 30%-ный раствор глиоксаля (технического) в H₂O соответствует приблизительно 7 М. Глиоксаль легко окисляется, и продукты его окисления можно удалить с помощью ионообменной хроматографии. Среди продуктов окисления гликолевая, глиоксиловая и муравьиная кислоты.
2. Деионизируйте, пропуская через колонку (сделанную из пипетки на 10 мл) с AG-501-X8 или AG-501-X8(0). На 1 мл глиоксаля нужно 0,5 мл смолы.
3. Храните в герметично закупоренных пробирках при -20°С. (Пробирки должны быть плотно закупорены, а воздушная прослойка - небольшой.)

Г. Стабильность глиоксаля

рН<6 - стабилен
рН 7 - стабилен в течение по крайней мере 20 ч
Константы скорости разложения: рН 8,0-0,001 мин-1
                               рН 10-0,02 мин-1
                               рН 11-0,06 мин-1

Литература

McMaster G. K., Carmichael G. G., 1977. Analysis of single- and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 4835.

St. John T. (личное сообщение).