НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

IV. Гели с глиоксалем

А. Приготовление образца

  1. Если концентрация нуклеиновой кислоты в препарате достаточно высока, то можно использовать непосредственно такой препарат. В противном случае осадите нуклеиновую кислоту эталоном и ресуспендируйте в H2O.
  2. В пробирке от микрофуги составьте пробу объемом 50 мкл: 25 мкл ДМСО (если необходимо добавлять больший объем препарата, то количество ДМСО можно уменьшить или вообще не добавлять его), 2,5 мкл 0,2 М NaPO4 (pH 7,0), 7,1 мкл 7М деионизованного глиоксаля, 15,3 мкл препарата.
  3. Закройте пробирку крышкой и инкубируйте в течение 60 мин при 50°С.
  4. Добавьте сахарозу или глицерол, бромфеноловый синий в качестве красителя и нанесите образец на гель.

Б. Гель

1. В качестве буфера для электрофореза используется 10 мМ NaPO4 (pH 7,0). 
2. Используется гель из 1-1,5%-ной агарозы или 0,5%-ной агарозы и 1,5-2%-ного раствора полиакриламида. 
3. Электрофорез проводится в течение 4-20 ч при 1 В/см. 
4. Необходима рециркуляция буфера в аппарате. 
5. а. Окрашивайте в растворе акридинового оранжевого с концентрацией 30 мкг/мл в течение 30 мин. Отмывайте, погрузив гель на 1 ч в 1 мМ Na3-ЭДТА. 

 или 

 б. Чтобы глиоксилирование не блокировало гибридизации нуклеиновых кислот, проведите обратную реакцию. Для этого выдержите гель в течение 30 мин в 200 мл 50 мМ NaOH. Нейтрализуйте гель и окрасьте нуклеиновую кислоту, поместив гель на 30 мин в 200 мл 0,2 М ацетат натрия (рН 4,0) с бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл. 
   Отмойте гель, поместив его на 30 мин в 0,2 М ацетат натрия (рН 4,0). 
6. Фотографирование. 
   а. Бромистый этидий: освещайте светом с длиной волны 254 нм и фотографируйте, используя УФ-фильтр и оранжевый фильтр. 
   б. Акридиновый оранжевый: освещайте светом с длиной волны 254 нм и фотографируйте, используя УФ-фильтр и желтый фильтр.

Двухцепочечная нуклеиновая кислота - флуоресценция в зеленой области спектра при 530 нм.

Одноцепочечная нуклеиновая кислота - флуоресценция в красной области спектра при 640 нм.

В. Приготовление глиоксаля

  1. 30%-ный раствор глиоксаля (технического) в H2O соответствует приблизительно 7 М. Глиоксаль легко окисляется, и продукты его окисления можно удалить с помощью ионообменной хроматографии. Среди продуктов окисления гликолевая, глиоксиловая и муравьиная кислоты.
  2. Деионизируйте, пропуская через колонку (сделанную из пипетки на 10 мл) с AG-501-X8 или AG-501-X8(0). На 1 мл глиоксаля нужно 0,5 мл смолы.
  3. Храните в герметично закупоренных пробирках при -20°С. (Пробирки должны быть плотно закупорены, а воздушная прослойка - небольшой.)

Г. Стабильность глиоксаля

рН<6 - стабилен
рН 7 - стабилен в течение по крайней мере 20 ч
Константы скорости разложения: рН 8,0-0,001 мин-1
                               рН 10-0,02 мин-1
                               рН 11-0,06 мин-1

Литература

McMaster G. K., Carmichael G. G., 1977. Analysis of single- and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 4835.

St. John T. (личное сообщение).

предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru