Методика 21. Перенос ДНК на нитроцеллюлозу или диазотированную бумагу

I. Перенос из агарозных гелей

А. Агарозный гель

1. Проведите электрофоретическое разделение ДНК, используя горизонтальный аппарат и гель размера 14,5×13,5×0,8 см (150 мл). Обычно мы используем 0,7%-ную агарозу и трис-ацетатный буфер.
2. В каждую лунку длиной 0,4 см можно нанести до 5 мкг ДНК, расщепленной рестриктирующей эндонуклеазой. Мы наносим около 1 мкг расщепленной бактериальной ДНК.
3. В буфер для электрофореза добавлен бромистый этидий (0,5 мкг/мл). При фотографировании гель освещают коротковолновым УФ-светом.

Б. Расщепление больших молекул ДНК в геле посредством депуринизации

Если используемая ДНК получена с помощью метода быстрого выделения, то депуринизацию проводить не нужно. По-видимому, при действии диэтилоксидиформата и прогрева в ней образовалось столько одноцепочечных разрывов, что стал возможным быстрый и полный ее перенос из геля. В этом случае можно опустить этапы 1-3 и начать прямо с этапа В-1.

1. Поместите гель [размером 14,5×13,5×0,8 см (150 мл)] в лоток и добавьте 250 мл 0,25 М HCl при комнатной температуре.
2. Периодически покачивайте в течение 15 мин. После этого слейте кислоту и повторите этапы 1 и 2.
3. Быстро сполосните гель водой и сразу же переходите к этапу В.

В. Денатурация щелочью

1. Добавьте 250 мл 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl, осторожно покачивайте в течение 15 мин.
2. Слейте щелочь и повторите этап В-1.

Г. Нейтрализация

1. Для переноса ДНК на нитроцеллюлозу нейтрализуйте, добавив 500 мл раствора, содержащего 0,5 М трис-HCl (рН 7,5) (60 г трис-основания и 30 мл концентрированной HCl на 1 л) и 1,5 М NaCl (90 г на 1 л) при комнатной температуре. Осторожно покачивайте в течение 30 мин.
2. Для переноса на диазотированную бумагу нейтрализуйте двумя порциями по 250 мл 1 М ацетата натрия (рН 4,0). В каждой порции выдерживайте по 30 мин. Удалите высокую концентрацию соли, промыв гель в течение 30-60 мин в 0,1 М ацетате натрия (рН 4,0).

Д. Перенос на бумагу

1. На большой лист пластика или на лоток положите стопку из 12 листов бумаги ватман 3ММ (листы размером 57×46 см нарежьте или сложите и разорвите на четыре части). Намочите их буфером. Смачивайте и накладывайте сразу по два листа. Пузырьки воздуха удаляйте, прокатывая стеклянную палочку или пипетку. Буфер: для переноса на нитроцеллюлозу используйте буфер SSPE 20 × (см. методику 23), для переноса на диазотированную бумагу - 0,1 М ацетат натрия (рН 4,0).
2. На бумагу 3ММ наложите гель.
3. Смочите водой лист нитроцеллюлозного фильтра (Schleicher and Schuell B85 или HAWP Millipore) или лист диазотированного фильтра, вырезанный по размерам геля. Наложите его на гель так, чтобы между фильтром и гелем не оказалось пузырьков воздуха.
4. На нитроцеллюлозный фильтр наложите пять смоченных водой листов бумаги 3ММ (вырезанных по размерам фильтра). Укладывайте их так, чтобы между листами не было воздушных пузырьков.
5. Сверху бумаги 3ММ уложите стопку бумажных полотенец, нарезанных по тому же размеру. Толщина стопки должна составлять около 6 см. Сверху положите тонкую пластинку плексигласа, на которую поместите груз весом в 1 кг.
6. Проводите перенос в течение не менее 2 ч.
7. Переверните фильтр вместе с усохшим гелем, и мягким карандашом отметьте на нем края геля и места лунок.
8. На 10 мин смочите нитроцеллюлозный фильтр буфером SSPE2 × и затем высушите в вакуумной печи при 80°С в течение 2 ч.
9. Проводите гибридизацию, как описано в методике 23.

Литература

Loh E. Y. (личное сообщение).

Southern E. M., 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, J. Mol. Biol, 98, 503.

Wahl G. M., Stern M., Stark G. R., 1979. Efficient transfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzyloxymethyl paper and rapid hybridization by using dextran sulfate, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 3683.