НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

II. Перенос из бляшек фага λ

1. Вырастите чашки LB с бляшками фага λ так, чтобы на чашке было 102-105 бляшек. Используйте сухие чашки или чашки, разлитые за 2 дня до опыта.

2. Чтобы агар стал твердым, охладите чашки с бляшками при 4°С. Держите их при этой температуре, от примерно 15 мин до нескольких часов.

3. На газон наложите сухой нитроцеллюлозный фильтр диаметром 82 мм (Schleicher and Schuell BA85 или HAWP Millipore). Следите, чтобы между агаром и фильтром не оказалось пузырьков воздуха.

4. Адсорбцию проводите в течение 1-20 мин.

5. а. Во время этой адсорбции сделайте отметки на фильтре и на чашке, чтобы фиксировать их взаимную ориентацию. Для этого можно проколоть каждый фильтр (в то время, когда он находится на чашке) по краю в трех местах шприцем с иглой номер 25 и нанести капли черных нерастворимых в воде чертежных чернил, в которые добавлена денатурированная немеченая ДНК-зонд в концентрации 1 мкг/мл. Объем наносимых капель составляет около 10 мкл. Чашки нужно помечать несимметрично и так, чтобы их можно было размечать.

б. Чтобы фиксировать ориентацию фильтра относительно чашки, нужно добавить на чашку с бляшками такой фаг, который можно на чашке идентифицировать и который будет гибридизоваться с зондом. Перед тем как поставить чашку инкубироваться, капните на газон около 10 частиц фага λgt5-lac5, pBR322. Можно также добавить 10-20 частиц фага λgt5-lac5, pBR322 при высеве 102-105 частиц испытываемого фага. В этих случаях высев проводят в верхнем агаре с Xgal (добавляется 40 мкл раствора Xgal в ДМСО с концентрацией 40 мг/мл, который хранят при -20°С).

6. Осторожно снимите фильтр с чашки.

7. Погрузите фильтр (или сразу всю партию фильтров) в 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl на время от 20 с до 5 мин.

8. Фильтр (или сразу всю партию) погрузите в 0,5 М трис (рН 7,5) и 1,5 М NaCl на время от 20 с до 5 мин.

9. Сполосните в буфере SSPE2 × (см. методику 23).

10. Промокните и отожгите в вакууме при 80°С в течение 1,5-2 ч.

11. Гибридизацию проводите, как указано в методике 23.

12. После того как проявите рентгеновскую пленку, наложите ее на обернутый в пластик фильтр. Перенесите на пленку те пометки, которые были сделаны на фильтре, чтобы фиксировать ориентацию и номер.

13. Наложите маркированную рентгеновскую пленку на исходную чашку. Выявите бляшки, дающие гибридизацию.

предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru