II. Перенос из бляшек фага λ

1. Вырастите чашки LB с бляшками фага λ так, чтобы на чашке было 10²-10⁵ бляшек. Используйте сухие чашки или чашки, разлитые за 2 дня до опыта.

2. Чтобы агар стал твердым, охладите чашки с бляшками при 4°С. Держите их при этой температуре, от примерно 15 мин до нескольких часов.

3. На газон наложите сухой нитроцеллюлозный фильтр диаметром 82 мм (Schleicher and Schuell BA85 или HAWP Millipore). Следите, чтобы между агаром и фильтром не оказалось пузырьков воздуха.

4. Адсорбцию проводите в течение 1-20 мин.

5. а. Во время этой адсорбции сделайте отметки на фильтре и на чашке, чтобы фиксировать их взаимную ориентацию. Для этого можно проколоть каждый фильтр (в то время, когда он находится на чашке) по краю в трех местах шприцем с иглой номер 25 и нанести капли черных нерастворимых в воде чертежных чернил, в которые добавлена денатурированная немеченая ДНК-зонд в концентрации 1 мкг/мл. Объем наносимых капель составляет около 10 мкл. Чашки нужно помечать несимметрично и так, чтобы их можно было размечать.

б. Чтобы фиксировать ориентацию фильтра относительно чашки, нужно добавить на чашку с бляшками такой фаг, который можно на чашке идентифицировать и который будет гибридизоваться с зондом. Перед тем как поставить чашку инкубироваться, капните на газон около 10 частиц фага λgt5-lac5, pBR322. Можно также добавить 10-20 частиц фага λgt5-lac5, pBR322 при высеве 10²-10⁵ частиц испытываемого фага. В этих случаях высев проводят в верхнем агаре с Xgal (добавляется 40 мкл раствора Xgal в ДМСО с концентрацией 40 мг/мл, который хранят при -20°С).

6. Осторожно снимите фильтр с чашки.

7. Погрузите фильтр (или сразу всю партию фильтров) в 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl на время от 20 с до 5 мин.

8. Фильтр (или сразу всю партию) погрузите в 0,5 М трис (рН 7,5) и 1,5 М NaCl на время от 20 с до 5 мин.

9. Сполосните в буфере SSPE2 × (см. методику 23).

10. Промокните и отожгите в вакууме при 80°С в течение 1,5-2 ч.

11. Гибридизацию проводите, как указано в методике 23.

12. После того как проявите рентгеновскую пленку, наложите ее на обернутый в пластик фильтр. Перенесите на пленку те пометки, которые были сделаны на фильтре, чтобы фиксировать ориентацию и номер.

13. Наложите маркированную рентгеновскую пленку на исходную чашку. Выявите бляшки, дающие гибридизацию.