Обсуждение

В бляшке фага λ содержится значительное количество ДНК (как в частицах фага, так и в виде свободной ДНК). При контакте с нитроцеллюлозным фильтром часть этой ДНК необратимо адсорбируется на нем. После этого адсорбированную ДНК можно денатурировать и проводить с ней гибридизацию, не вызывая ее смещения. В результате удается локализовать те бляшки, в которых есть последовательность ДНК, гибридизующаяся с радиоактивным зондом. С каждой чашки можно сделать по крайней мере семь таких отпечатков.

1. При использовании чашек LB пятна гибридизации получаются сильнее, чем при использовании чашек для фага λ, хотя бляшки на первых и оказываются мельче. Допустимое число бляшек на чашку зависит от размера бляшек. Если бляшки на чашке сливаются, то пятен гибридизации видно не будет. Поскольку размер бляшек обратно пропорционален количеству высеваемых для газона клеток, то при необходимости можно сделать бляшки нужной величины. Использование подсушенных чашек снижает вероятность захвата частиц верхнего агара на этапе 6.
2. Повышение твердости агара при охлаждении предотвращает захват частиц верхнего агара на этапе 6.
3. Можно пользоваться нестерильными фильтрами прямо из упаковки. Если под фильтром окажутся пузырьки воздуха, то они будут препятствовать переносу ДНК на фильтр. В этом месте ошибочно будет получен отрицательный результат.
4. Адсорбция происходит почти мгновенно. Поэтому после того, как фильтр коснулся чашки, не сдвигайте его.
5. Это одна из наиболее сложных операций. Рекомендуем пользоваться вторым методом (5, б). При расщеплении Xgal β-галактозидазой образуется Соединение голубого цвета. Фаг, который несет область lac, образует в присутствии Xgal голубые бляшки. Такие бляшки остаются голубыми в течение по крайней мере нескольких дней. Так как Xgal не является индуктором, то большинство клеток газона окраски не дает. Фаг с областью lac индуцирует синтез β-галактозидазы потому, что репрессор этого оперона титруется большим числом копий оператора.
6. Будьте осторожны, чтобы не захватить верхний слой агара. Если это произойдет, то смойте агар на этапе 7.
7. (Этапы 7-10); это обычные процедуры, выполняемые при работе с нитроцеллюлозой. Точное выполнение этих операций не является критическим. Даже при опускании этапов 7-9 слабые сигналы гибридизации все еще будут наблюдаться. Не проводите отжига фильтров в течение более 2 ч и не нагревайте их выше 80°С. В противном случае фильтры станут еще более ломкими, чем обычно.
8. (Этапы 11 и 12); как правило, трудно сопоставить пятна почернения на пленке с определенными бляшками на чашке. Обычно из той области чашки, в которой произошла гибридизация, мы зубочисткой или платиновой проволочкой перекалываем несколько бляшек на газон чувствительных клеток. Если пять раз уколоть примерно в одно и то же место, то образуется большая бляшка. Перекалывайте бляшки по шаблону. С чашки с переколотыми по шаблону бляшками снимите фильтр-реплику. После того как выявите бляшки нужных фагов, проведите их очистку и повторную проверку.

Литература

Benton W. D., Davis R. W., 1977. Screening of λgt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ, Science, 196, 180.