III. Перенос из бактериальных колоний

1. Вырастите колонии, посеянные по шаблону на селективную чашку.

2. Получите отпечаток на сухой нитроцеллюлозный фильтр (диаметром 82 мм; Schleicher and Schuell BA85 или HAWP Millipore) или на смоченную (бульоном) бумагу ватман 540.

Пользуйтесь каким-либо из следующих способов:

а. Положите фильтр прямо на колонии, пока они еще достаточно малы. После этого перенесите фильтр на свежую селективную чашку, поместив его таким образом, чтобы сторона с колониями была обращена не к среде, а к воздуху. Таким образом можно сделать только один отпечаток.

б. С помощью бархата перепечатайте колонии на фильтр, положенный на новую селективную чашку. Таким способом можно сделать несколько отпечатков.

в. Вырастите колонии в ячейках планшета для микротитрования. С помощью штампа перенесите их на фильтр. Таким способом можно получить много отпечатков, на которые нанесены одинаковые количества клеток.

3. Когда на фильтре вырастут колонии, фильтр осторожно снимите.

Пометьте его ориентацию, пользуясь мягким карандашом или сделав на фильтре вырезы.

Чтобы потом ориентировать рентгеновскую пленку и чтобы проверить способность гибридизоваться и эффективность мечения ДНК-зонда, нанесите на фильтр каплю с 10 нг денатурированной немеченной ДНК-зонда.

Каждый фильтр должен быть маркирован по-своему и несимметрично.

4. Положите фильтр на два листа бумаги 3ММ (14×23 см), намоченных в 30 мл 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl, на 3-10 мин. Фильтр нужно накладывать так, чтобы та сторона, на которой находятся колонии, была обращена вверх.

5. Чтобы удалить избыток жидкости, перенесите фильтр на лист сухой бумаги 3ММ. Фильтр кладите так, чтобы сторона с колониями находилась сверху.

6. На 3-10 мин положите фильтр на два листа бумаги 3ММ (14×23 см), намоченных 30 мл 0,5 М трис (рН 7,5) и 1,5 М NaCl. Фильтр накладывайте так, чтобы сторона с колониями была обращена вверх.

7. Поместите фильтр (стороной с колониями вверх) на аппарат для отсасывания (воронку), включите насос. Дважды сполосните 25 мл 90%-ного этанола, отсасывайте досуха.

8. Промокните между листами фильтровальной бумаги. Отожгите с прижатой фильтровальной бумагой при 80°С в вакууме в течение 1,5-2 ч.

9. Гибридизацию проводите, как указано в методике 23.

10. Проявленную рентгеновскую пленку совместите с завернутым в пластик фильтром. Пометьте на пленке ориентацию и маркировку фильтра.

11. Совместив маркированную рентгеновскую пленку с исходной чашкой, выявите те колонии, в которых произошла гибридизация.

Литература

Grunstein M., Hogness D. S., 1975. Colony hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene, Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961.