Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

V. Выделение меченой ДНК

 А. 1. Нанесите реакционную смесь на колонку 0,7×20 см (Bio-Rad Econo-column) с сефадексом G-50,
предварительно уравновешенным буфером ТЕ (10 мМ трис и 1 мМ Na3-ЭДТА, рН 7,5).
Сухой сефадекс G-50 набухает 3 ч. 
   2. Промойте буфером ТЕ (10 мМ трис и 1 мМ Na3-ЭДТА, pH 7,5). 
   3. Вытекающую жидкость собирайте порциями по 0,5 мл в полипропиленовые пробирки.
ДНК обычно элюируется после 2 мл промывки. За положением ДНК, меченной 32P,
в колонке можно следить, пользуясь ручным счетчиком. 
   4. Соберите первый пик, отбросив хвост. 

Б. 1. Проколите крышку и дно полипропиленовой центрифужной пробирки на 0,5 мл иглой номер 27.
(Сделайте одно отверстие в дне и четыре в крышке).
   2. Вставьте проткнутую пробирку в полипропиленовую центрифужную пробирку на 1,5 мл со снятой крышкой. 
   3. Во внутреннюю пробирку внесите 100 мкл биогеля P60 (50-100 меш),
суспендированного в 10 мМ трис (рН 7,5), 1 мМ Na3-ЭЛТА, 0,2% ДСН. 
  Сверху наслоите 300-400 мкл биогеля Р60 (100-200 меш), суспендированного в том же буфере. 
   4. Всю эту конструкцию из пробирок поставьте в клиническую центрифугу (если необходимо, все это можно поместить в другую пробирку). 
     а. Центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 об/мин. 
     б. Добавьте 100 мкл буфера для промывки: 10 мМ трис (рН 7,5), 1 мМ Na3-ЭДТА, 0,2% ДСН. 
     в. Центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 об/мин. 
     г. Внутреннюю пробирку вставьте в чистую наружную пробирку. 
     д. Образец разведите до 50 мкл и нанесите на биогель. 
     е. Центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 об/мин. 
     ж. Добавьте 50 мкл буфера для промывки и центрифугируйте. 
     з. В нижней пробирке собирается около 100 мкл ДНК, меченной 32P. 
5. При центрифугировании на высокой скорости через отверстие в дне пробирки могут пройти зерна Р60.
Чистоту центрифуги от радиоактивности проверьте с помощью ручного счетчика. 
предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"