Обсуждение

Приведенные выше условия гибридизации разработаны для проведения гибридизации с уникальной последовательностью бактериальной ДНК, когда на фильтр из геля элюировано в сумме около 1 мкг бактериальной ДНК. Если вносится больше меченого зонда, то можно получить более сильный сигнал и уменьшить время гибридизации. При использовании зонда, меченного ¹²⁵I для получения низкого фона, гибридизацию надо вести в течение не более трех часов. Неизвестно, почему при использовании меченной ¹²⁵I тРНК^Tyr при длительной гибридизации получается высокий фон.

Если используемый зонд гомологичен ДНК высших животных, то в качестве носителя нужно использовать не ДНК из спермы лосося, а какую-нибудь другую, например бактериальную, ДНК. ДНК-носитель можно добавить прямо в зонд, и тогда ее не нужно дополнительно добавлять при гибридизации.

Двухцепочечную ДНК можно денатурировать любым способом. Однако если концентрация соли в ней выше, чем в буфере ТЕ, то мы рекомендуем проводить денатурацию щелочью. Если зонд повторно используется после длительной гибридизации в водном растворе, его можно денатурировать NaOH. Добавьте к зонду 1/10 объема 1,5 М NaOH и через 10 мин добавьте 1/10 объема 1,5 М НС1. Если зонд в формамиде, то можно использовать тепловую денатурацию. Зонд становится наполовину ренатурированным в соответствии с таким уравнением:

Время, за которое происходит наполовину ренатурация в формамиде (в часах) = 0,05 · (объем в мл) · (сложность зонда [kb])/(вес зонда [мкг]).

Так как одна из участвующих в гибридизации нуклеиновых кислот-партнеров иммобилизована на твердой подложке, то трудно предсказать время, необходимое для оптимальной или хотя бы достаточной для выявления гибридизации. Лучше всего определить это время эмпирически.

Основная вариабильность результатов, получаемых при использовании этой методики, определяется материалом и качеством фильтров. Обычно для посадки одноцепочечной ДНК используют нитроцеллюлозные фильтры фирм Millipore (HAWP 00010) или Schleicher and Schuell (BA85). Однако от партии к партии фильтров количество ДНК, связывающейся с ними, и уровень фона варьируют.

Для того чтобы блокировать адсорбцию на фильтре меченой одноцепочечной ДНК-зонда, достаточно присутствия ДСН и ДНК-носителя. Как правило, при проведении обычной гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах не обязательно использовать раствор BFP.