Методика 23. Гибридизация с иммобилизованной ДНК или РНК на твердом носителе

1. В полипропиленовую пробирку внесите зонд (меченный ³²P или ¹²⁵I с помощью ник-трансляции), растворенный в буфере TE [10 мМ трис (рН 7,5), 1 мМ Na₃-ЭДТА). Используйте зонд в количестве, соответствующем примерно 10⁶-5·10⁶ расп./мин.

2. а. Чтобы денатурировать ДНК, прогрейте в течение 10 мин при 95°С.

или

б. Добавьте ¹/₁₀ объема 1 М NaOH. Через 10 мин добавьте ¹/₁₀ объема 1,8 М трис-HCl и 0,2 М трис-основание.

3. Поместите фильтры с иммобилизованной ДНК или РНК в пластиковый мешочек, который можно заварить.

4. а. Добавьте примерно 4 мл раствора, содержащего буфер SSPE 5× + 0,3% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной и разрушенной ультразвуком ДНК-носителя (из спермы лосося) и 50% (об/об) формамида (МСВ), в расчете на 100 см² фильтра.

или

б. Проведите предварительную обработку фильтра. Поместите его в мешочек, который можно заварить, и в расчете на фильтр площадью 100 см² добавьте 4 мл раствора, содержащего 50% (об/об) формамида (МСВ), SSPE 5×, BFP5X [BFP 1× = 0,02% (в/об) бычьего сывороточного альбумина, фиколла (мол. вес 400000) и поливинилпирролидона], 1% глицина и 100 мкг/мл денатурированной и обработанной ультразвуком ДНК-носителя (из спермы лосося). Инкубируйте при 42°С не менее 1 ч. Удалите раствор, использованный при такой предварительной обработке. Для фильтра площадью 100 см² приготовьте 4 мл раствора, содержащего 50% (об/об) формамида, SSPE 5×, BFP 1×, 100 мкг/мл денатурированной и обработанной ультразвуком ДНК-носителя (из спермы лосося), 10% (в/об) натриевой соли декстрансульфата 500 [можно приготовить исходный раствор 50% (в/об)] и 0,3% ДСН. Половину этого раствора добавьте в мешочек с фильтром и перемешайте. К оставшейся половине добавьте денатурированный зонд, хорошо перемешайте и все это добавьте в мешочек. Натриевую соль декстрансульфата можно не добавлять.

или

в. На фильтр площадью 100 см² добавьте около 4 мл раствора, содержащего SSPE 5× + 0,3% ДСН и 100 мкг/мл денатурированной и обработанной ультразвуком ДНК-носителя (из спермы лосося).

5. Добавьте денатурированную ДНК-зонд в количестве ~10⁶ расп./мин. Следите, чтобы ³²P не попал на тот участок мешочка, где его будете заваривать. Заварите мешочек.

6. Герметизированный мешочек (мешочки) поместите в другой мешочек и тоже заварите его. Чтобы не допустить высыхания фильтра, в наружный мешочек положите влажное бумажное полотенце.

7. а-б. Если гибридизацию проводите в 50%-ном растворе формамида, то ведите ее в течение 3-48 ч при 42°С.

или

в. Если гибридизацию проводите в водной среде, то ведите ее при 65°С в течение 3-24 ч.

8. Удалите из мешочка радиоактивную гибридизационную смесь. Ее можно использовать для повторных гибридизаций (см. обсуждение).

9. Разрежьте мешочек и выньте фильтр.

10. а. Промойте три-четыре раза, инкубируя с покачиванием при 45°С по 5-15 мин в 250 мл раствора SSPE 2× + 0,2% ДСН.

или

б. Промойте три-четыре раза, инкубируя при 37°С по 5-15 мин в 250 мл раствора 20 мМ Na_1,5H_1,5PO₄ + 0,2% ДСН и 1 мМ Na₃-ЭДТА.

или

в. Промойте три-четыре раза, инкубируя по 5-15 мин при комнатной температуре в 250 мл 10 мМ Na_1,5H_1,5PO₄ + 0,2% ДСН и 1 мМ Na₃-ЭДТА.

11. Высушите фильтр, заверните его в пластик и экспонируйте с рентгеновской пленкой. Для того чтобы маркировать и ориентировать фильтр, можно завернуть вместе с ним в пластик кусочек бумаги, надписанный радиоактивными чернилами. (См. методику 24.)

BFP 100× = 2% (в/об) бычьего сывороточного альбумина, фиколла и поливинилпирролидона.