II. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности KI

1. Отделите нужный фрагмент, проведя электрофорез в агарозном геле. Используйте трис-ацетатный или трис-фосфатный буфер (см. методику 20), содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
2. Осветите длинноволновым УФ-светом лишь небольшую полоску геля, чтобы УФ не повредил основной гель. Вырежьте кусочек геля, содержащий ДНК, и взвесьте его.
3. Растворите гель в насыщенном растворе KI.
4. Добавьте бромистый этидий до конечной концентрации около 50 мкг/мл.
5. Доведите плотность до 1,5 г/мл. Показатель преломления η₂₀=0,1731·ρ+1,1617 (выполняется для 1,3≤ρ≤1,7).
6. Центрифугируйте до достижения равновесия при 30000 об/мин и 20°С в течение 24-48 ч.

Литература

Blin N., Gabain A. V., Bujard H., 1975. Isolation of large molecular weight DNA from agarose gels for further digestion by restriction enzymes, FEBS Lett., 53, 84.