Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

III. Электроэлюция ДНК в гидроксилапатит

  1. С помощью электрофореза в агарозном геле отделите нужный фрагмент. Используйте трис-ацетатный буфер (методика 20), содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Слейте из аппарата столько буфера, чтобы поверхность геля оказалась выше его уровня.
  2. Осветите гель длинноволновым УФ-светом и разглядите полосы ДНК. Непосредственно перед нужной полосой вырежьте лунку шириной 1-2 мм.
  3. Заполните эту лунку плотной взвесью гидроксилапатита НТР Bio-Rad (в трис-ацетатном буфере для электрофореза). Заполните лунку доверху, добавляя взвесь по мере осаждения частиц.
  4. Осторожно залейте гель буфером и продолжайте электрофорез. Освещая гель длинноволновым УФ-светом, следите за движением полосы ДНК из геля в гидроксилапатит.
  5. После того как полоса полностью выйдет из геля, прекратите электрофорез. Пользуясь пастеровской пипеткой, перенесите гидроксилапатит в другую пастеровскую пипетку, которая заткнута силиконизированной стеклянной ватой и закреплена таким образом, что получилась маленькая колонка.
  6. Промойте эту колонку пятью объемами (обычно 5 раз по 200 мкл) буфера 10 мМ KPO4 (рН 6,8) с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Промойте еще пятью объемами буфера 100 мМ KPO4 с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
  7. Элюируйте ДНК буфером 400 мМ KPO4 с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Собирайте небольшие фракции (~50 мкл) и следите за флуоресценцией под длинноволновым УФ-светом.
  8. Объедините фракции, которые содержат ДНК. Проведите экстракцию фенолом, насыщенным буфером.
  9. Отберите водную фазу. Диализуйте ее в течение ночи против 10 мМ трис-HCl (рН 8) и 1 мМ Na3-ЭДТА.

Литература

Tabak H. F., Flavell R. A., 1978. A method for the recovery of DNA from agarose gels, Nucleic Acids Res., 5, 2321.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"