III. Электроэлюция ДНК в гидроксилапатит

1. С помощью электрофореза в агарозном геле отделите нужный фрагмент. Используйте трис-ацетатный буфер (методика 20), содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Слейте из аппарата столько буфера, чтобы поверхность геля оказалась выше его уровня.
2. Осветите гель длинноволновым УФ-светом и разглядите полосы ДНК. Непосредственно перед нужной полосой вырежьте лунку шириной 1-2 мм.
3. Заполните эту лунку плотной взвесью гидроксилапатита НТР Bio-Rad (в трис-ацетатном буфере для электрофореза). Заполните лунку доверху, добавляя взвесь по мере осаждения частиц.
4. Осторожно залейте гель буфером и продолжайте электрофорез. Освещая гель длинноволновым УФ-светом, следите за движением полосы ДНК из геля в гидроксилапатит.
5. После того как полоса полностью выйдет из геля, прекратите электрофорез. Пользуясь пастеровской пипеткой, перенесите гидроксилапатит в другую пастеровскую пипетку, которая заткнута силиконизированной стеклянной ватой и закреплена таким образом, что получилась маленькая колонка.
6. Промойте эту колонку пятью объемами (обычно 5 раз по 200 мкл) буфера 10 мМ KPO₄ (рН 6,8) с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Промойте еще пятью объемами буфера 100 мМ KPO₄ с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
7. Элюируйте ДНК буфером 400 мМ KPO₄ с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Собирайте небольшие фракции (~50 мкл) и следите за флуоресценцией под длинноволновым УФ-светом.
8. Объедините фракции, которые содержат ДНК. Проведите экстракцию фенолом, насыщенным буфером.
9. Отберите водную фазу. Диализуйте ее в течение ночи против 10 мМ трис-HCl (рН 8) и 1 мМ Na₃-ЭДТА.

Литература

Tabak H. F., Flavell R. A., 1978. A method for the recovery of DNA from agarose gels, Nucleic Acids Res., 5, 2321.