Методика 26. Быстрая оценка концентрации ДНК с использованием бромистого этидия

I. Метод с использованием чашки с агарозой

1. В чашки Петри разлейте по 10 мл 1%-ного раствора агарозы с 0,5 мкг/мл бромистого этидия в любом удобном буфере с низкой концентрацией соли (можно использовать, например, оставшийся после приготовления геля раствор).
2. На чашку с агарозой нанесите каплей 1 -10 мкл того раствора ДНК, концентрацию которого нужно определить.
3. Каплями нанесите такие же объемы каких-нибудь препаратов ДНК с известной концентрацией. Наносите их в определенном порядке, начиная с концентрации около 0,5 мкг/мл и вплоть до 20 мкг/мл.
4. Оставьте чашки, чтобы капли впитались в агарозу. (Чашки оставляют на разное время - начиная с 15 мин и кончая перерывом в работе на ночь.).
5. Сфотографируйте под коротковолновым УФ-светом и сравните интенсивность флуоресценции.
6. Если концентрация ДНК в исследуемом препарате оказалась выше 20 мкг/мл, то сделайте несколько разведений и вновь сравните их с образцами, концентрация которых известна.
7. Препарат ДНК может содержать небольшие молекулы, которые мешают определить концентрацию ДНК, вызывая усиление флуоресценции (например, небольшие молекулы РНК) или гася флуоресценцию бромистого этидия (например, сахароза, ДСН, NaC1O₄ или формамид). В этом случае оставьте чашку на ночь, и тогда эти соединения, препятствующие определению концентрации ДНК, диффундируют в окружающую агарозу.