Методика 27. Электронная микроскопия ДНК

I. Водная методика

F. Метод расправления

1. Расправляющий раствор. Используйте 30 мкл раствора: 5 мкл 5 М ацетата аммония и 1 мг/мл цитохрома с, 25 нг ДНК, H₂O до конечного объема 50 мкл.
2. Нижняя фаза (0,25 М ацетат аммония).

Б. Метод капли

1. 3,5 мкл 5 М ацетата аммония и 1 мг/мл цитохрома c.
2. 25 нг ДНК.
3. H₂O до конечного объема 50 мкл. Поместите каплю на тефлон или любую другую несмачиваемую поверхность. Коснитесь сеточкой боковой стороны капли. Этот метод дает лучшие результаты в случае небольших ДНК (например, ДНК фага φX174 или вируса SV-40).

В. Окрашивание

1. В 10 мл 90%-ного этанола добавьте 10 мкл уранилацетата (0,05 М уранилацетат и 0,05 М HCl в H₂O).
2. Храните закрытым, в темноте.
3. Окрашивайте сеточки в течение 30 с.
4. Споласкивайте 5 с в 90%-ном этаноле.

Литература

Davis R. W., Simon M. N., Davidson N., 1971. Electron microscope heteroduplex methods for mapping regions of base sequence homology in nucleic acids, Methods Enzymol., 21 D, 413.

Ferguson J., Davis R. W., 1978. Quantitative electron microscopy of nucleic acids. In: Advanced techniques in biological electron microscopy II (Koehler J. K., ed.), p. 123.