II. Формамидная методика [1984 Девис Р., Ботстайн Д., Рот Д. - Методы генетической инженерии. Генетика бактерий]

А. 1. Расправляющий раствор. Используйте 50 мкл раствора: 10 мкл 1 М трис-HCl (рН 8,5), 0,1 М Na₃-ЭДТА и 0,5 мг/мл цитохрома c, 25 нг ДНК, H₂O до конечного объема 60 мкл, 40 мкл формамида. 2. Нижняя фаза (приготавливается не ранее чем за 5 мин до использования): 0,01 М трис и Ю-3 М Na₂-ЭДТА (рН 8,5) (100 мл), 10%-ный формамид (10 мл). Б. Окрашивание 1. В 10 мл 90%-ного этанола добавьте 10 мкл основного раствора уранилацетата (0,05 М уранилацетат и 0,05 М HCl в H₂O). 2. Храните закрытым, в темноте. 3. Окрашивайте сеточки в течение 30 с. 4. Промывайте по 5 с в 90%-ном этаноле. В. Изоденатурирующие условия (для ряда расправляющих растворов и нижних фаз)

Расправляющий раствор	Нижняя фаза
1. 30%-ный раствор формамида	5%-ный раствор формамида
0,1 М трис (рН 8,5)	0,01 М трис (рН 8,5)
0,01 М Na₂-ЭДТА	0,001 М Na₂-ЭДТА
2. 40%-ный раствор формамида	10%-ный раствор формамида
0,1 М трис (рН 8,5)	0,01 М трис (рН 8,5)
0,01 М Na₂-ЭДТА	0,001 М Na₂-ЭДТА
3. 50%-ный раствор формамида	20%-ный раствор формамида
0,1 М трис (рН 8,5)	0,01 М трис (рН 8,5)
0,01 М Na₂-ЭДТА	0,001 М Na₂-ЭДТА
4. 60%-ный раствор формамида	30%-ный раствор формамида
0,1 М трис (рН 8,5)	0,01 М трис (рН 8,5)
0,01 М Na₂-ЭДТА	0,001 М Na₂-ЭДТА
5. 70%-иый раствор формамида	40%-ный раствор формамида
0,1 М трис (рН 8,5)	0,01 М трис (рН 8,5)
0,01 М Na₂-ЭДТА	0,001 М Na₂-ЭДТА
6. 80%-ный раствор формамида	50%-ный раствор формамида в дистиллированной воде
0,05 М трис (рН 8,5)
0,005 М Na₂-ЭДТА

Литература

Davis R. W., Hyman R. W., 1971. A study in evolution: Homology between coliphages T7 and T3, J. Mol. Biol., 62, 287.

Davis R. W., Simon M. N., Davidson N., 1971. Electron microscope heteroduplex methods for mapping regions of base sequence homology in nucleic acids, Methods Enzymol, 21 D, 413.