2.1.1. История развития цитогенетики человека [1989 Фогель Ф., Мотульски А.Г.

Первые наблюдения митотических хромосом человека [522]. Можно сказать, что исследования по цитогенетике человека начались с работ Арнольда (1879) [297] и Флемминга (1882) [348], которые впервые наблюдали митотические хромосомы человека. В последующие годы появилось много сообщений, в которых приводились различные оценки числа хромосом у человека. Среди этих ранних исследований выделяется работа Винивортера (1912) [543]. Он исследовал гистологические срезы тестикул от четырех человек разного возраста - 21, 23, 25 и 41 год. Из фиксированного материала были приготовлены срезы только одной толщины - 7,5 мк, что недостаточно для корректного подсчета хромосом. В этих препаратах исследовали 32 сперматогониальных митоза. В 29 из них Винивортер насчитал 47 элементов, в двух других - 46 и в одном - 49 (рис. 2.1). Кроме этого было обнаружено 60 клеток на стадии диплотены, в 57 из них выявлено 24 элемента, в двух - 25 и в одной - 23. Он наблюдал в диплотене даже половой бивалент, но расценил его как одну хромосому, сместившуюся к полюсу. Винивортер пришел к выводу, что у мужчины должно быть 47 хромосом, а у женщины - 48. Данных относительно оогенеза было еще меньше, поскольку ему удалось обнаружить только три четких оогониальных митоза в материале от четырехмесячного плода. Результаты анализа подтвердили предположение о наличии в клетках женщин 48 хромосом.

Рис. 2.1. Одно из первых изображений митоза в сперматогониях [543]

Существенным импульсом для развития цитогенетики человека явились данные Пэйнтера (1921, 1923) [467]. Он исследовал тестикулы трех душевнобольных (причиной удаления тестикул во всех случаях было "выраженное отсутствие самоконтроля в сочетании с определенной степенью помешательства"). Основные результаты были получены при исследовании препаратов от двух больных. В предварительном сообщении (1921) Пэйнтер определил число хромосом как 46 или 48, но в заключительной статье (1923) он пришел к выводу о наличии в клетках человека 48 хромосом. В первом мейотическом делении Пэйнтер обнаружил половой бивалент, состоящий из X и Y хромосом, которые в анафазе перемещались к противоположным полюсам (рис. 2.2). В последующие годы цифра 48 подтверждалась многими авторами [379]. Дальнейшему прогрессу препятствовали две технические трудности.

Рис. 2.2 Половой бивалент в первой анафазе мейоза [467]

Эти трудности в конце концов были преодолены благодаря: а) использованию суспензий интактных клеток, из которых можно было получать давленые препараты (или просто высушивать на воздухе) без приготовления гистологических срезов; б) кратковременной обработке клеток гипотоническим раствором, в результате чего клетки набухают и лопаются, а хромосомы свободно распределяются в препарате.

Метод гипотонического шока существенно облегчил подсчет хромосом [384, 386]. (Интересно заметить, что данные Пэйнтера о наличии у человека 48 хромосом настолько запечатлелись в умах исследователей, что даже спустя 30 лет в первых публикациях по цитогенетике человека с использованием новой техники фигурировала цифра 48 [384].)

Старая ошибка исправлена, началась новая эра [352]. Летом 1955 г. Леван (шведский цитогенетик) во время своего визита в лабораторию Хсю в Нью-Йорке обучился методике получения давленых препаратов с использованием гипотонического шока. Он и Тио усовершенствовали затем этот метод, сократив время гипотонической обработки и добавив обработку колхицином - химическим веществом, которое, разрушая нити веретена деления, останавливает митоз на стадии метафазы и увеличивает, таким образом, количество клеток, пригодных для подсчета хромосом. Эти авторы исследовали фибробласты легкого, полученные от четырех эмбрионов человека. Изучив 261 метафазную пластинку, к своему удивлению, они обнаружили, что в большей части клеток присутствует 46 хромосом. На рис. 2.3 в качестве примера показана одна метафаза из их работы. Обсуждая эти данные, Тио и Леван упомянули о работе трех шведских цитогенетиков, которые за год до них изучали митоз в клетках печени абортированных эмбрионов человека и прекратили свои исследования, поскольку не могли обнаружить 48 хромосом: во всех клетках они находили только 46 хромосом. Тио и Леван были весьма осторожны в своих выводах:

"Мы не хотим утверждать, что число хромосом у человека составляет 2π=46, пока не будет проведен тщательный анализ числа хромосом в митозе сперматогониев, однако именно такой вывод следует сделать из наших наблюдений".

Рис. 2.3. Метафазная пластинка культивируемых in vitro фибробластов легкого эмбриона человека. Фотография из первого сообщения, в котором констатировалось наличие в клетках человека 46 хромосом [532]

Необходимое доказательство вскоре было получено Фордом и Хамертоном (1956) [351]. Они исследовали препараты из тестикул трех мужчин пожилого возраста. В подавляющем большинстве клеток, находящихся на стадии метафазы I мейоза, было найдено 23 бивалента, что соответствовало результатам Тио и Левана. Хотя сперматогониев, делящихся митотически, было обнаружено очень мало, анализ четких препаратов подтвердил, что число хромосом равно 46. По существу эти результаты ознаменовали начало развития клинической цитогенетики, хотя до описания первого аномального кариотипа у человека оставалось еще почти три года.

Решение старой загадки: синдром Дауна обусловлен трисомией по 21 хромосоме. Предположение Ваарденбурга было окончательно подтверждено весной 1959 г., когда Лежен с соавт. [417] опубликовали результаты изучения хромосом в культивируемых фибробластах кожи от девяти детей с болезнью Дауна. Было исследовано 57 диплоидных клеток. Во всех клетках оказалось 47 хромосом. Авторы описали лишнюю хромосому как маленькую и "телоцентрическую". В качестве наиболее подходящего объяснения наличия дополнительной хромосомы было выдвинуто предположение о нерасхождении гомологов в мейозе.

Первые сообщения о трисомии и моносомии по половым хромосомам. Еще в 1949 г. Барр и Бертрам [298] открыли "Х-хроматин" - плотное овальное образование размером 0,8-1,1 мкм, которое обычно локализуется на периферии интерфазного ядра у самок млекопитающих и отсутствует у самцов. Это открытие было сделано случайно. Авторов вовсе не интересовали половые различия, они изучали действие утомления на центральную нервную систему кошек. Однако то, что сначала представлялось характерным только для нейронов кошек, оказалось нормальным признаком, присущим клеточным ядрам самок всех млекопитающих, в том числе и женщин. Гомологичные структуры, "барабанные палочки" (drumsticks), были обнаружены Дэвидсоном и Смитом (1954) [331] в ядрах полиморфноядерных лейкоцитов. Естественно, что вслед за этим необходимо было ответить на вопрос, присутствует ли X-хроматин в клетках больных с нарушениями полового развития. Оказалось, что большинство больных с синдромом Клайнфельтера (разд. 2.2.3.2), несмотря на преобладание в фенотипе мужских черт, являются хроматин-положительными, в то же время большинство больных с синдромом Тернера (разд. 2.2.3.3) являются хроматин-отрицательными, что не согласуется с их женским фенотипом. Следовательно, если Х-хроматин имеет прямое отношение к Х-хромосоме, то эти данные указывают на аномалию по Х-хромосоме при указанных синдромах.

Еще в 1931 г. Гольдшмидт предложил метод определения генотипического пола у интерсексов. Поскольку прямых методов изучения половых хромосом не существовало, перспективным казалось исследование дальтонизма, обычно наследуемого как Х-сцепленный признак. В двух выборках, охватывающих 89 случаев синдрома Клайнфельтера, у трех больных были обнаружены соответствующие аномалии цветового зрения (разд. 3.5.3) [462; 478]. Такая частота (3,4%) не вполне соответствовала ожидаемой для мужчин (7-9%), но, с другой стороны, она была намного выше, чем ожидалось для женщин (менее 1%). Если бы эти три пациента имели нормальный женский кариотип 46, XX, они должны были бы получить по одной из Х-хромосом от каждого из родителей. Поскольку дальтонизм проявляется только у гомозиготных женщин, ожидалось, что отцы этих больных также имеют аномалию цветового зрения. В действительности же двое обследованных отцов дальтонизмом не страдали. Эти факты прояснились, когда Джекобс и Стронг (1959) [395], исследуя хромосомы в клетках костного мозга больных с синдромом Клайнфельтера, обнаружили 47 хромосом, причем родители больных имели нормальный кариотип. Дополнительная хромосома принадлежала к группе, включающей Х-хромосому. Кариотип был идентифицирован предположительно как XXY. У двух больных с синдромом Клайнфельтера и аномалией цветового зрения (отцы которых нормально различали цвета) обе Х-хромосомы были явно материнского происхождения, попавшими в одну половую клетку вследствие мейотического нерасхождения (разд. 5.1.2.3).

Вскоре после этого первого сообщения наличие XXY-кариотипа при синдроме Клайнфельтера было подтверждено многими авторами. В настоящее время общеизвестно, что именно этот кариотип является стандартным при данном заболевании. Изучение хромосомного набора больных с синдромом Тернера (при котором также существует расхождение между ядерным и фенотипическим полом) продемонстрировало наличие в их кариотипе 45 хромосом, причем половые хромосомы были представлены единственной хромосомой X. Третья аномалия - трисомия по Х-хромосоме была обнаружена у женщины с умеренной умственной отсталостью и дисфункцией половых желез [393].

Возможности для изучения генетической детерминации пола у человека, которые открываются благодаря существованию аномалий половых хромосом, будут обсуждаться в разд. 2.2.3.

Рождение цитогенетики человека 1956-1959 гг.: научная революция. Мы уже писали о том, что существует различие между "нормальным развитием" науки и периодически возникающими "научными революциями" [257]. Научная революция характеризуется появлением новой теории, которая первоначально находит поддержку лишь у небольшой группы ученых. Если эта новая теория обнаруживает свое преимущество, предлагая решение ранее неразрешимых проблем и ставя новые, более сложные задачи, она признается научным сообществом и каждый исследователь в данной области включается в разработку различных ее аспектов.

Развитие цитогенетики в 1956-1960 гг. явилось именно такой "революцией": возникла новая область исследований. Теперь любые рассуждения о регуляции активности генов, их сцеплении, структуре генетического материала, спонтанных и индуцированных мутациях, популяционной генетике, эволюции человека, а также о практическом использовании генетических знаний в профилактике наследственных болезней могли оказаться устаревшими без учета данных и новых представлений цитогенетики человека. Правда, с точки зрения экспериментальной генетики цитогенетика человека выглядела скромно: многие её достижения можно было рассматривать как запоздалое приложение к человеку тех идей, которые были известны давно, иногда более полувека тому назад. Однако в настоящее время цитогенетика человека достигла высокого уровня и находится на переднем крае фундаментальной цитогенетики.

Чем же можно объяснить революцию в этой области биологии? Как это часто бывает, причиной ее были методические усовершенствования: гипотоническая обработка улучшила распределение хромосом в препарате, а вместо тканевых срезов стали анализировать отдельные клетки. Важно также, что "нашлись" ученые, которые сумели реализовать возможности, предоставленные новыми методами.

Группа исследователей, совершивших революцию в цитогенетике человека. Возможности новых методов были реализованы в два этапа. Тио и Леван [532] открыли точное число хромосом, но, будучи слишком далекими от медицины, они не связали свое открытие с патологией человека. На этом первом этапе наиболее удачное взаимодействие концепций общей цитогенетики и медицины было достигнуто группой британских ученых. Больших успехов в этот период достиг и французский исследователь Лежен [417]. Как правило, в ходе научной революции группа ученых, работающих на основе новой концепции, создает свою собственную сеть научного взаимодействия. С этой точки зрения ранний период развития цитогенетики человека представляет особый интерес для историков науки. Важно провести такое исследование как можно скорее, пока многие из первооткрывателей еще активно работают. Один из них, Харнден, предоставил нам следующую интересную информацию.

Ведущими фигурами в британской группе были Форд в Харуэлле и Браун в Эдинбурге. Оба работали в подразделениях, финансировавшихся Медицинским исследовательским советом (MRC). Интерес Форда к хромосомам человека возник в связи с его исследованиями опухолей у мышей и мейотических клеток. Браун стал изучать хромосомы человека, поскольку он как эпидемиолог ощущал необходимость сочетания эпидемиологических и фундаментальных биологических исследований. Вскоре эти группы установили контакт. Патриция Джекобс, цитогенетик (немедик), была направлена Брауном к Форду. Работая в его лаборатории, она сумела приспособить метод кратковременной культуры клеток костного мозга для исследований хромосом человека. Харнден в это же время разработал методику культивирования фибробластов кожи. Он считал ее более удачной, чем культивирование клеток костного мозга. Эдинбургская группа работала при больнице, и ей был доступен клинический материал. По-видимому, именно здесь врач Стронг, в настоящее время профессор медицины, высказал идею исследовать хромосомы при синдроме Клайнфельтера. В Харуэлле, где работал Форд, не было прямой связи с больницей. Однако вскоре такой контакт был установлен (Guy's hospital), и Полани предложил исследовать синдром Тернера. Сотрудничество между этими двумя группами было очень интенсивным. Взаимодействие осуществлялось с помощью писем, телефонных переговоров. Каких-либо особых совещаний не проводилось. Специалисты по генетике человека Полани, Пенроуз и Эдвардс посылали материал в Харуэлл и консультировали по медицинским вопросам лабораторных работников. Идея исследовать хромосомный набор больных с синдромом Дауна пришла к английским ученым как следующий естественный шаг после выявления хромосомных аномалий при синдромах Клайнфельтера и Тернера. По-видимому, эта идея возникла независимо в Харуэлле и в Эдинбурге, и обе группы успели значительно продвинуться в этом направлении до того, как узнали о работе Лежена.

Успех двух британских групп стал возможным благодаря сотрудничеству ученых различных специальностей. Тесный контакт поддерживался в течение нескольких лет, пока объединявшая эти группы концепция набирала силу. Затем контакт стал медленно ослабевать. Однако в то же самое время две другие группы цитогенетиков независимо осознали преимущество новых методов: их возглавляли Лежен во Франции и Фраккаро и Линдстен в Швеции. Последние приступили к изучению синдрома Тернера, не зная об исследованиях в Харуэлле.

Наиболее важные этапы развития цитогенетики человека

Клиническая цитогенетика - наиболее популярная специальность в генетике человека. Начиная с 1960 г. цитогенетика человека, и в особенности клиническая цитогенетика, стали наиболее популярными разделами генетики человека. Конечно, это можно объяснить тем, что была вскрыта причина многих прежде необъяснимых пороков развития. Другое объяснение заключается в том, что врачи предпочитают увидеть причину болезни своими глазами, и поэтому понятия формальной и популяционной генетики по большей части их не привлекают. Понятно также, что постепенное уменьшение популярности клинической цитогенетики в последующие годы объяснялось отсутствием какого-либо практического значения ее результатов для лечения или профилактики, не считая диагностику и генетическое консультирование. Однако ситуация резко изменилась, когда появилась возможность дородовой диагностики.