2.2. Картирование генов пластид

Пластиды присущи всем фотосинтезирующим растениям. Среди микроорганизмов основной объект их генетического изучения - одноклеточные зеленые водоросли, преимущественно Chlamydomonas reinhardii. В клетках хламидомонад при цитологическом исследовании обнаруживается один хлоропласт, в котором содержится около 15 % всей клеточной ДНК. ДНК протопласта по плавучей плотности и составу отличается от ядерной. Она представлена кольцевыми молекулами размером около 40 мкм, содержащимися в вегетативных клетках по 40-60, а в гаметах - по 20-30 копий. Хлоропласт - клеточная органелла, осуществляющая фотосинтез. Некоторые компоненты системы фотосинтеза у хламидомонады кодируются генами хлоропластов, другие - ядерными. Мутации хлоропластных генов лишают клетку способности к фотосинтезу (такие мутанты выращивают на среде с ацетатом) или придают ей устойчивость к разным ингибиторам.

Особенностью мутаций, происходящих в ДНК хлоропласта, является то, что в скрещиваниях они показывают однородительскую (только со стороны mt⁺ - родителя: mt⁺/mt^- - аллели локуса типа спаривания) передачу признака потомству. Естественно, такой характер наследования - препятствие для проведения рекомбинационного анализа в скрещиваниях, где родительские формы отличаются двумя или более признаками, детерминированными генетической системой хлоропласта. Препятствие это можно, однако, обойти, используя либо редкие спонтанно возникающие "двуродительские" зиготы (т. е. зиготы, в мейотическом потомстве которых представлены аллели хлоропластных генов обоих родительских клеток), либо УФ - свет, облучая клетки mt⁺ до спаривания, что приводит к существенному повышению частоты двуродительских зигот. Рекомбинация хлоропластных генов может быть учтена в потомстве отобранных тем или иным способом двуродительских зигот. Для этого устанавливают генотипы либо ближайших потомков четырех мейотических спор, либо клеток, составляющих колонии, берущие начало от отдельных зигот. Естественно, что интерпретация результатов должна следовать какой-то генетической модели, описывающей поведение хлоропластного генофора при оплодотворении, мейозе и последующих митотических делениях. Сэджер [2] считает, что при образовании рекомбинантов у хламидомонады взаимодействуют лишь две копии хлоропластного генофора, и соответственно предлагает методы генетического анализа. Ею построена карта, показывающая локализацию примерно 10 различных хлоропластных мутаций. По-видимому, сейчас эта карта представляет только исторический интерес. Методы генетического анализа Сэджер были подвергнуты критике, а ее модель вызывает серьезные сомнения [3]. Вероятно, правильнее для анализа генетических результатов скрещиваний в этом случае применять популяционные модели, подобные разработанным в генетике митохондрий.

В результате изучения физической структуры хлоропластной ДНК хламидомонады обнаружена одна ее особенность, которая также существенно затрудняет проведение генетического анализа рекомбинации. Оказалось, что в кольцевой молекуле этой ДНК содержатся два инвертированных повтора рибосомальных генов. Внутримолекулярная гибридизация по этим повторам должна приводить к появлению в клетках двух форм молекул, отличающихся порядком расположения своих частей (генов). Это - существенное пряпятствие для формального генетического анализа генных порядков.

На современной генетической карте хлоропластной ДНК Chlamydomonas reinhardii (см. рис. 7.15) указано местоположение нескольких генов, которое удалось определить, используя делеционные мутанты, а главное, применяя молекулярную гибридизацию специфических РНК- и ДНК-проб с фрагментами хлоропластной ДНК, полученными при действии разных рестриктаз. Такой подход сейчас наиболее плодотворен [10].